【摘要】：研究背景:近年來(lái),多孔鈦合金支架由于具有顯著的機(jī)械性能,較少的應(yīng)力屏蔽和較好的促進(jìn)新骨生長(zhǎng)作用已受到相當(dāng)大的關(guān)注。具有可控幾何形狀,孔徑大小和孔隙率的多孔鈦合金支架是用于骨替代修復(fù)的首選材料。支架材料在植入后從周圍組織血管中得到營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)對(duì)于支架材料的存活和成骨至關(guān)重要。新的血管形成對(duì)于支架的存活并發(fā)揮功能是必需的。關(guān)于多孔鈦合金表面修飾的研究已有相當(dāng)多年的發(fā)展,相關(guān)的報(bào)道也有很多.通過(guò)對(duì)多孔鈦合金進(jìn)行表面生物學(xué)改性來(lái)提高其活性,但是依然存在著骨生長(zhǎng)不足,而且對(duì)于血管化這個(gè)支架材料存活至關(guān)重要的指標(biāo)研究報(bào)道很少。骨生長(zhǎng)不足和缺乏血管化向內(nèi)生長(zhǎng)進(jìn)入多孔鈦合金支架限制了它們的進(jìn)一步應(yīng)用。因此,具有骨生成和血管生成特性的生物功能涂層對(duì)于多孔鈦合金支架長(zhǎng)期固定和存活以及其臨床應(yīng)用至關(guān)重要。鎂金屬是一種可降解金屬材料,鎂離子在人體骨代謝中扮演著重要的角色。近年來(lái)大量的研究報(bào)道,鎂基合金與鈦合金相比具有更好的生物學(xué)活性,在骨折修復(fù)和骨缺損重建中可以促進(jìn)新骨生長(zhǎng)。但由于鎂基合金容易發(fā)生腐蝕效應(yīng)導(dǎo)致快速降解,降解后出現(xiàn)力學(xué)支撐不足等缺點(diǎn),限制了鎂基合金作為移植材料在骨科中的應(yīng)用。近年來(lái),關(guān)于如何提高鎂合金材料耐腐蝕性的研究報(bào)道有很多,但是直接將鎂金屬作為生物可降解涂層制備于鈦合金材料表面的研究尚未發(fā)現(xiàn)。鎂金屬涂層的生物活性、成骨效應(yīng)和血管化能力都有待于進(jìn)一步探索和研究。方法:1.應(yīng)用電子束熔融技術(shù)(EBM)制備多孔Ti6Al4V支架材料,采用脈沖偏壓電弧離子鍍技術(shù)在多孔Ti6Al4V支架材料內(nèi)、外表面制備鎂金屬涂層。掃描電鏡觀察多孔Ti6Al4V支架材料表面及孔隙內(nèi)部涂層形態(tài),能譜分析檢測(cè)其元素組成。2.利用小鼠成骨前體細(xì)胞系(MC3T3-E1)來(lái)進(jìn)行多孔Ti6Al4V支架材料體外成骨活性的研究。利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)來(lái)檢測(cè)支架材料的體外促血管化活性。將MC3T3-E1和HUVEC兩種細(xì)胞分別與生物活性鎂涂層修飾的多孔Ti6Al4V支架材料的浸提液共同培養(yǎng),檢測(cè)細(xì)胞生物相容性。利用alamar Blue比色測(cè)定法檢測(cè)MC3T3-E1和HUVEC兩種細(xì)胞的增殖情況;Calcein-AM/PI雙染色試劑盒檢測(cè)兩種細(xì)胞的活力。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察兩種細(xì)胞在不同浸提液培養(yǎng)下的黏附、伸展?fàn)顩r。通過(guò)堿性磷酸酶染色,茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色,實(shí)時(shí)定量PCR來(lái)檢測(cè)生物活性鎂涂層修飾的多孔Ti6Al4V支架材料的浸提液對(duì)于MC3T3-E1的成骨促進(jìn)作用。通過(guò)劃痕試驗(yàn),Transwell試驗(yàn),成管試驗(yàn),實(shí)時(shí)定量PCR來(lái)檢測(cè)生物活性鎂涂層修飾的多孔Ti6Al4V支架材料的浸提液對(duì)于HUVEC血管化的促進(jìn)作用。3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)取成年新西蘭大白兔42只,采用新西蘭大白兔的股骨髁部骨缺損模型來(lái)評(píng)價(jià)生物活性鎂涂層修飾的多孔Ti6Al4V支架材料的長(zhǎng)期成骨性能以及早期血管化性能。選擇在術(shù)后第6、9、12個(gè)月進(jìn)行影像學(xué)和組織學(xué)染色等方法進(jìn)行支架材料長(zhǎng)期成骨效果的分析。由于鈣黃綠素、茜素紅和四環(huán)素在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)無(wú)法長(zhǎng)時(shí)間留存,會(huì)出現(xiàn)熒光衰減現(xiàn)象,故采用術(shù)后12周時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)研究。而對(duì)于早期血管化研究,選擇在術(shù)后第2、4、8周進(jìn)行微血管造影,顯微CT等方法進(jìn)行分析。結(jié)果:1.掃描電鏡發(fā)現(xiàn)規(guī)則、均勻、致密的鎂金屬晶粒分布在多孔Ti6Al4V支架材料的內(nèi)外表面,與材料表面結(jié)合良好,能譜分析結(jié)果顯示單相鎂涂層存在于材料表面;2.Alamar Blue比色測(cè)定法結(jié)果表明:相較于單純多孔Ti6Al4V支架材料,生物活性鎂涂層修飾的多孔Ti6Al4V支架材料在細(xì)胞培養(yǎng)第4、7、14天時(shí)可以促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的增殖(p0.05);CLSM結(jié)果顯示與生物活性鎂涂層修飾的多孔Ti6Al4V支架材料浸提液共培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞黏著斑蛋白的表達(dá)量出現(xiàn)明顯的增加,且細(xì)胞總面積/細(xì)胞核面積比例明顯增加(p0.05);生物活性鎂涂層修飾的多孔Ti6Al4V支架材料浸提液可以促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的堿性磷酸酶活性和細(xì)胞外基質(zhì)礦化及鈣結(jié)節(jié)的形成;生物活性鎂涂層修飾的多孔Ti6Al4V支架材料浸提液可以促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的遷移、侵襲及小管形成能力;實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明,生物活性鎂涂層修飾的多孔Ti6Al4V支架材料浸提液可以促進(jìn)成骨相關(guān)基因ALP、Col-1、OPN、OCN和成血管相關(guān)基因VEGF、HIF-1α的表達(dá);3.Micro-CT結(jié)果顯示與單純多孔Ti6Al4V支架材料相比,在第6、9、12月時(shí)生物活性鎂涂層修飾的多孔Ti6Al4V支架材料組BV/TV明顯增高(p0.05);骨組織熒光三標(biāo)結(jié)果顯示生物活性鎂涂層修飾的多孔Ti6Al4V支架材料組在12周時(shí)具有更高的熒光標(biāo)記強(qiáng)度;組織學(xué)VG染色結(jié)果顯示,在6、9、12月時(shí)生物活性鎂涂層修飾的多孔Ti6Al4V支架材料組BV/TV明顯增高(p0.05),且骨組織與支架的整合效果更佳;微血管灌注造影發(fā)現(xiàn),植入后2周,生物活性鎂涂層修飾的多孔Ti6Al4V支架材料組的BVV/TV值(21.2±3.2%)顯著高于單純多孔Ti6Al4V支架材料組(10.9±1.8%,p0.05)。4周時(shí),生物活性鎂涂層修飾的多孔Ti6Al4V支架材料組的BVV/TV值為35.3±4.5%,明顯高于單純多孔Ti6Al4V支架材料組(15.5±3.4%,p0.05)。植入8周后觀察到類似的結(jié)果。結(jié)論:1.利用掃描電鏡和X射線能譜分析觀察驗(yàn)證成功的制備出了具有優(yōu)良孔隙率、孔徑等參數(shù)的多孔Ti6Al4V支架材料,并在多孔Ti6Al4V支架材料表面成功利用多弧離子鍍的方法制備出了結(jié)合緊密的高純度鎂金屬涂層。2.體外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)生物活性鎂涂層修飾的多孔Ti6Al4V支架材料可以在體外促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的增殖、黏附、伸展;促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的遷移、侵襲以及小管形成;促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化和HUVEC細(xì)胞的血管化。3.通過(guò)體內(nèi)研究證實(shí)生物活性鎂涂層修飾的多孔Ti6Al4V支架材料具備良好的促進(jìn)新骨生成能力,并且有利于骨組織與支架材料的整合。同時(shí),生物活性鎂涂層修飾的多孔Ti6Al4V支架材料促進(jìn)了周圍組織的早期血管化,為支架材料內(nèi)部的新骨生成提供了充分的營(yíng)養(yǎng)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R318.08;R68
【圖文】：

一、骨缺損修復(fù)的研究進(jìn)展骨的結(jié)構(gòu)遭到物理性或者化學(xué)性的破壞，使骨結(jié)構(gòu)失去了完整性形成骨缺損。正常骨組織的結(jié)構(gòu)如圖 1 所示。導(dǎo)致骨缺損的原因通常有車禍、戰(zhàn)爭(zhēng)、工作性切割損傷等外部原因和骨髓炎、結(jié)核、骨腫瘤、各種骨組織先天性遺傳性疾病等內(nèi)部原因?qū)е耓1]。由于骨組織具有強(qiáng)大的自我修復(fù)能力，對(duì)于小的骨缺損而言，可以通過(guò)骨組織自我修復(fù)功能進(jìn)行修復(fù)，但對(duì)于大的缺損超過(guò)機(jī)體骨組織自我修復(fù)能力時(shí)往往需要通過(guò)骨移植術(shù)來(lái)進(jìn)行修復(fù)[2]。骨缺損的治療一直以來(lái)是一個(gè)長(zhǎng)久困擾臨床醫(yī)生和研究人員的難題，往往難以取得滿意的效果，給病人本身及家庭和社會(huì)都會(huì)帶來(lái)沉重的身體心理壓力和經(jīng)濟(jì)壓力。臨床上目前對(duì)于骨缺損的治療方法主要有三大類，第一類是自體骨移植術(shù)[3-6]；第二類是同種異體骨移植術(shù)[7-10]；第三類是人工骨替代材料[11-13]。

可以較為有效的緩解由于彈性模量不匹配導(dǎo)致的應(yīng)力遮擋效應(yīng)，有利于植入后的骨修復(fù)和重建。但是表相多孔鈦合金存在一些問(wèn)題，由于表面的多孔結(jié)構(gòu)主要通過(guò)燒結(jié)等方法制備，與內(nèi)部鈦合金實(shí)體部分結(jié)構(gòu)的結(jié)合界面容易出現(xiàn)斷裂，并導(dǎo)致植入的支架材料出現(xiàn)松動(dòng)，容易導(dǎo)致植入手術(shù)的失敗。體相多孔鈦合金的均勻孔隙從內(nèi)到外貫穿整個(gè)支架材料，避免了表相多孔鈦合金由于存在受力不均勻?qū)е碌闹Ъ苤踩氩牧辖Y(jié)合界面結(jié)構(gòu)出現(xiàn)斷裂的情況。體相多孔鈦合金材料內(nèi)外表面大量相互連通的孔隙結(jié)構(gòu)可以為成骨細(xì)胞向內(nèi)部遷移、增殖提供良好的孔道結(jié)構(gòu)，有利于支架材料內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的自由流通和交換。多孔鈦合金的孔隙長(zhǎng)入新生骨組織后形成機(jī)械鎖固結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了多孔鈦合金植入體與周圍骨組織的結(jié)合強(qiáng)度，可以獲得較好的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。通過(guò)調(diào)整體相多孔鈦合金的參數(shù)，調(diào)整材料孔隙率、孔徑大小可以獲得符合特定要求的具有特定彈性模量和力學(xué)強(qiáng)度等參數(shù)的多孔鈦合金支架材料，滿足不同植入要求。因此，體相多孔鈦合金是目前比較理想的移植物修復(fù)材料。

圖 3.多孔鈦合金結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)，增材制造的示意圖[15, 57]與 EBM 應(yīng)用電子束作為能源不同，SLM 技術(shù)使用波長(zhǎng)可調(diào)的激光束作為將鈦金屬粉末融化來(lái)制備多孔鈦合金支架材料。在計(jì)算機(jī)的輔助下，可以制備出仿生骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)的多孔鈦合金支架材料，具備良好的生物相容性。通過(guò) SL以制備出特定孔隙率和孔徑的多孔鈦合金支架材料。但是由于 SLM 使用激光束能源，能量密度不足，融化金屬粉末來(lái)制備多孔鈦合金速度較慢。EBM 具有更擴(kuò)散能量（較大的熱影響區(qū)域），EBM 制造過(guò)程可制備出具有較小特征尺寸，中小的粉末顆粒、層厚度、分辨率和表面光潔度的支架材料。EBM 技術(shù)是近年來(lái)新興的先進(jìn)金屬快速成型制造技術(shù)，通過(guò)電子束所產(chǎn)生的高能量融化金屬粉末，融化的金屬粉末凝固形成金屬網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。隨后在形成的金屬網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上繼續(xù)制二層金屬網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，金屬網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)層與層之間相互融合、連接。如此層層累積，制備出完整的多孔鈦合金支架材料。與傳統(tǒng)的工藝相比，EBM 不受內(nèi)外部復(fù)雜

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