本文關(guān)鍵詞：慢病毒介導(dǎo)Pannexin3基因促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:通過對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Stem Cells,BMSCs)進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染Pannexin3基因進(jìn)而研究Pannexin3對(duì)成軟骨分化的影響。方法:通過提取大鼠股骨、脛骨骨髓,用貼壁培養(yǎng)法體外培養(yǎng)大鼠BMSCs,傳至第三代,對(duì)其進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo),Western Blot檢測0d.3d.7d.14d.21d Pannexin3表達(dá)情況。再次體外培養(yǎng)大鼠BMSCs,傳至第三代,并按照以下情況分組:空白對(duì)照組:不作處理;空載體(Mock)轉(zhuǎn)染組:轉(zhuǎn)染帶有Mock陰性基因的慢病毒;Pannexin3轉(zhuǎn)染(Panx3)組:轉(zhuǎn)染攜帶Pannexin3基因的慢病毒;轉(zhuǎn)染48h后熒光顯微鏡觀察Panx3組和Mock組的熒光表達(dá),并評(píng)估轉(zhuǎn)染效率;三組均用成軟骨誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng);倒置相差顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)的BMSCs和誘導(dǎo)后各組細(xì)胞的生長情況;MTT法繪制各組細(xì)胞誘導(dǎo)后0h.24h.48h.72h時(shí)生長曲線;培養(yǎng)至第14天,予以甲苯胺藍(lán)染色對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定;RT-PCR檢測軟骨特異性標(biāo)記物II型膠原(Collagen-type II,COL II)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)m RNA的表達(dá);Western Blot檢測各組細(xì)胞Pannexin3及β-catenin的表達(dá)情況;實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示,應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,組間及兩兩參數(shù)比較用單因素方差分析,方差整齊時(shí)兩兩比較行LSD檢驗(yàn),方差不齊時(shí)行Tamhane檢驗(yàn),當(dāng)P0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs體外培養(yǎng)生長狀況:靜置培養(yǎng)48h后有少量細(xì)胞貼壁,96h后可見細(xì)胞部分細(xì)胞形態(tài)為長梭形,并呈由中央向四周放射,第三代BMSCs培養(yǎng)至第4天可鋪滿90%左右,呈螺旋狀排列,細(xì)胞形態(tài)均勻,呈長梭形;2.Western Blot結(jié)果顯示大鼠BMSCs成軟骨誘導(dǎo)過程中,隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加,Pannexin3表達(dá)量逐漸上升,于14天達(dá)高峰,21天表達(dá)下調(diào);3.倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs成軟骨誘導(dǎo)后的形態(tài)變化及生長情況:于誘導(dǎo)后48h可見所有細(xì)胞存在收縮現(xiàn)象,細(xì)胞數(shù)量不變,細(xì)胞長度變短,隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加,培養(yǎng)板中所有細(xì)胞逐漸收縮變?yōu)闄E圓形,部分細(xì)胞脫壁死亡,剩余細(xì)胞存在明顯聚集現(xiàn)象;4.熒光顯微鏡下觀察Panx3組及Mock組轉(zhuǎn)染呈現(xiàn)出顯著的綠色熒光,轉(zhuǎn)染效率約為85%;5.MTT結(jié)果顯示隨著時(shí)間的增加,三組細(xì)胞均有增殖,24h時(shí)Panx3組BMSCs吸光值即小于對(duì)照組及Mock組(P0.05),48h及72h時(shí)Panx3組吸光值明顯小于對(duì)照組及空載體轉(zhuǎn)染組(P0.05);6.在三組BMSCs成軟骨誘導(dǎo)14d后,對(duì)照組、Mock組、Panx3組甲苯胺藍(lán)染色均呈現(xiàn)陽性;7.RT-PCR顯示成軟骨誘導(dǎo)后14d Panx3組軟骨特異性標(biāo)記物II型膠原(Collagen-type II,COL II)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)m RNA的表達(dá)較對(duì)照組及空載體轉(zhuǎn)染組高(P0.05);8.Western Blot顯示成軟骨誘導(dǎo)后14天Panx3組Pannexin3的表達(dá)高于對(duì)照組及Mock組(P0.05),而β-catenin表達(dá)明顯低于另外兩組(P0.05)。結(jié)論:1.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化過程中,Pannexin3的表達(dá)在3d時(shí)即有增加,7d時(shí)即有明顯增加,14d時(shí)達(dá)高峰,Pannexin3在BMSCs成軟骨分化中起重要作用;2.攜帶Pannexin3基因的慢病毒在成功感染BMSCs后對(duì)細(xì)胞的增殖起到了抑制作用;3.Pannexin3能夠促進(jìn)軟骨分化;4.Pannexin3促進(jìn)軟骨分化的方式可能與Wnt/β-catenin通路的失活有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 軟骨分化 縫隙連接蛋白 泛連接蛋白 Wnt/β-catenin信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R68
【目錄】：

• 中英文縮略詞對(duì)照表4-5
• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-12
• 材料12-15
• 實(shí)驗(yàn)方法15-22
• 結(jié)果22-31
• 討論31-35
• 結(jié)論35-36
• 參考文獻(xiàn)36-40
• 綜述40-50
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 致謝50-51
• 作者簡介51

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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1 歐陽柳;縫隙連接在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化過程中的作用[D];華中科技大學(xué);2010年

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本文編號(hào)：274003