【摘要】：骨肉瘤是青少年最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤,具有較高的致殘、致死率,單純手術(shù)治療的5年生存率僅20%。自上世紀70年代末引入化療以來,確診為骨肉瘤的患者在接受藥物治療后5年生存率明顯提高。同時,保肢手術(shù)配合關(guān)節(jié)假體的開展使患者能夠恢復患肢的功能和外形。因此,骨肉瘤患者的遠期生存和生活質(zhì)量得到明顯提高。目前,如何解決化療耐藥成為臨床上的棘手問題。首先,化療耐藥使得骨肉瘤患者需改用高強度化療方案,必然會帶來極大的全身不良反應。第二,化療耐藥導致骨肉瘤患者局部復發(fā),使保肢術(shù)后再次截肢,給患者造成嚴重的心理負擔,加速疾病發(fā)展。第三,長期的化療失敗使得腫瘤發(fā)生廣泛的肺轉(zhuǎn)移,最終造成呼吸衰竭及多器官不可逆衰竭。目前這類患者的5年生存率不足20%。端粒是真核細胞染色體末端、有著重要生物學功能的特殊結(jié)構(gòu)。端粒酶是維持端粒長度的關(guān)節(jié)酶,由端粒酶催化亞基端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)、端粒RNA(TERC)及端粒酶相關(guān)蛋白(TP)等3部分組成。正常機體內(nèi),端粒酶僅存在于精原細胞及少量體細胞內(nèi)。而大部分腫瘤中,均可檢測到端粒酶的活性。TERT與腫瘤的關(guān)系一直是研究的熱點,TERT參與腫瘤周期改變、細胞凋亡發(fā)生,在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平參與癌基因組的激活或抑制。而作為最有效的化療藥物之一的順鉑,主要作用靶點為細胞DNA,干擾DNA復制,誘導細胞凋亡。因此,TERT與順鉑在骨肉瘤的關(guān)系值得進一步探討。第一部分TERT線粒體轉(zhuǎn)移參與骨肉瘤細胞耐藥研究[目的]通過順鉑處理骨肉瘤細胞,同普通培養(yǎng)的骨肉瘤細胞相比,探究耐藥骨肉瘤細胞和非耐藥骨肉瘤細胞中TERT的表達及定位情況。[方法]通過獲取并培養(yǎng)骨肉瘤細胞系MG63、U20S和143B于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基中。通過qRT-PCR法和Western-blot法檢測并比較5μmol/L的順鉑處理24小時后的骨肉瘤細胞中TERTmRNA和蛋白表達情況,并利用共聚焦免疫熒光顯微鏡觀測TERT表達位置。隨后通過Western-blot法檢測并比較兩組骨肉瘤細胞線粒體中TERT蛋白表達水平。[結(jié)果]骨肉瘤耐藥細胞中TERT mRNA和蛋白表達水平均高于正常骨肉瘤細胞。TERT在骨肉瘤耐藥細胞中發(fā)生了線粒體轉(zhuǎn)移。[結(jié)論]骨肉瘤耐藥細胞中TERT表達明顯升高,并向線粒體進行轉(zhuǎn)移。第二部分TERT抑制線粒體凋亡通路及降低胞內(nèi)ROS水平促進骨肉瘤細胞耐藥[目的]探究TERT在骨肉瘤細胞耐藥中所起的作用及機制。[方法]合成TERT慢病毒并感染至骨肉瘤細胞中,通過嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定感染的骨肉瘤細胞系TERT野生型(TERT-WT)、TERT突變型(TERT-CI)、TERT低表達型(TERT-siRNA)和空轉(zhuǎn)對照(Control)。利用Western-blot法對4組骨肉瘤細胞TERT表達情況進行檢測。5μmol/L的順鉑處理4組骨肉瘤細胞24小時后,通過流式細胞儀及免疫熒光顯微鏡檢測細胞凋亡情況。利用Western-blot法檢測4組細胞線粒體凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和Bcl-xl表達情況。通過caspase-3、細胞色素c氧化酶(COX)試劑盒檢測4組細胞caspase-3和COX活性。利用流式細胞儀檢測4組骨肉瘤細胞內(nèi)ROS水平。通過谷胱甘肽(GSH/GSSG)試劑盒檢測4組骨肉瘤細胞0至6小時內(nèi)GSH/GSSG比例情況,通過谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽還原酶(GR)試劑盒檢測4組骨肉瘤細胞GPx和GR活性。[結(jié)果]成功構(gòu)建TERT-WT、TERT-CI、TERT-siRNA和Control穩(wěn)轉(zhuǎn)骨肉瘤細胞系。通過Western-blot法檢測發(fā)現(xiàn)TERT-WT和TERT-CI骨肉瘤細胞中TERT表達量升高且無統(tǒng)計學差異,TERT-siRNA骨肉瘤細胞中TERT表達量明顯降低。流式細胞儀及免疫熒光顯微鏡檢測4組骨肉瘤細胞凋亡水平發(fā)現(xiàn),TERT-WT和TERT-CI細胞中凋亡比率明顯降低且無統(tǒng)計學差異,而TERT-siRNA細胞中凋亡比率明顯升高。利用Western-blot法發(fā)現(xiàn)TERT-WT和TERT-CI細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl表達明顯升高而促凋亡蛋白Bax表達顯著降低,在TERT-siRNA細胞中三種凋亡蛋白的表達情況完全相反。檢測Caspase-3活性發(fā)現(xiàn)TERT-WT和TERT-CI細胞中caspase-3活性降低,而TERT-siRNA細胞中caspase-3活性增強。COX活性檢測顯示TERT-WT和TERT-CI細胞中COX活性明顯升高,而TERT-siRNA細胞中COX活性明顯降低。利用流式細胞儀檢測了四組骨肉瘤細胞內(nèi)ROS水平,在順鉑處理后的TERT-WT和TERT-CI骨肉瘤細胞中,ROS水平明顯降低,而TERT-siRNA骨肉瘤細胞中ROS水平明顯升高。谷胱甘肽檢測發(fā)現(xiàn)順鉑處理4組骨肉瘤細胞后的第6小時,TERT-WT和TERT-CI骨肉瘤細胞中GSH/GSSG水平明顯升高,而TERT-siRNA骨肉瘤細胞中GSH/GSSG水平明顯降低。GPx和GR胞內(nèi)活性檢測顯示,TERT-WT和TERT-CI骨肉瘤細胞中GPx和GR活性明顯升高,而TERT-siRNA骨肉瘤細胞中GPx和GR活性明顯降低。[結(jié)論]TERT通過線粒體途徑抑制順鉑對骨肉瘤細胞誘導的凋亡并降低胞內(nèi)ROS水平,且這種作用不依賴端粒酶活性。第三部分TERT促進骨肉瘤細胞耐藥體內(nèi)實驗研究與機制[目的]體內(nèi)實驗驗證TERT增強骨肉瘤細胞耐藥的作用并繪制機制網(wǎng)絡圖。[方法]取24只裸鼠隨機分為4組,每組6只。4組裸鼠分別接種TERT-WT、TERT-Cl、TERT-siRNA和Control143B骨肉瘤細胞構(gòu)建移植瘤模型。于骨肉瘤細胞接種后第4周開始使用濃度為5mg/kg的順鉑,每周1次,持續(xù)4周。監(jiān)測腫瘤大小8周,每周測量移植瘤體積并重復三次。于第八周檢測4組裸鼠中移植瘤重量。Western-blot法檢測4組移植瘤組織中Bax、Bcl-2和Bcl-xl的表達水平。[結(jié)果]TERT-WT和TERT-CI異種移植瘤在第4周體積無明顯區(qū)別。TERT-siRNA異種移植瘤生長的最慢,且在第4周時腫瘤的體積最小。順鉑處理4周后,相比對照組移植瘤,TERT-WT和TERT-CI異種移植瘤體積和重量最大,而TERT-siRNA異種移植瘤體積和重量最小。對四種異種移植瘤組織進行Western-blot檢測凋亡蛋白表達水平發(fā)現(xiàn),TERT-WT和TERT-CI異種移植瘤中Bax表達水平最低,而TERT-siRNA異種移植瘤中Bax表達水平最高。Bcl-2和Bcl-xl在TERT-WT和TERT-CI異種移植瘤中表達水平最高,而在TERT-siRNA異種移植瘤中表達水平最低。[結(jié)論]體外實驗證明TERT增強骨肉瘤異種移植瘤抵抗順鉑的能力。TERT通過降低骨肉瘤細胞內(nèi)ROS水平,抑制線粒體凋亡通路從而使骨肉瘤細胞免于順鉑的殺傷。
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R738.1
【圖文】：

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【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Shintaro Nomura;;In situ detection of TGF betas, TGF beta receptor II mRNA and telomerase activity in rat cholangiocarcinogenesis[J];World Journal of Gastroenterology;2003年03期

本文編號：2738545