【摘要】：創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)是一種常見的由于外力引起腦部神經(jīng)功能障礙和神經(jīng)細(xì)胞死亡的損傷性疾病,能夠?qū)е聡?yán)重的生理、心理以及認(rèn)知功能方面障礙。為了有效治療TBI,迫切需要一種新型的治療方法。干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)的出現(xiàn)為TBI治療提供新的思路。研究發(fā)現(xiàn),干細(xì)胞移植可以通過旁分泌和細(xì)胞替代途徑對TBI發(fā)揮保護(hù)作用。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)具有更新速度快、低免疫原性和畸胎瘤形成風(fēng)險(xiǎn)低等特點(diǎn),具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。TBI損傷之后由于組織缺血和炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生大量的活性氧,引起組織病理和細(xì)胞死亡,阻礙移植后細(xì)胞的遷移和存活。MG53蛋白(Mitsugumin53 protein,MG53)是TRIM(Tripartite motif,TRIM)家族蛋白成員之一,也是細(xì)胞膜修復(fù)中的重要組成部分。在嚙齒類動(dòng)物和大多數(shù)動(dòng)物模型中,MG53蛋白可以保護(hù)多種細(xì)胞膜免受破壞,同時(shí)也能改善肌營養(yǎng)不良、急性肺損傷、心肌梗死和急性腎臟損傷等疾病,而且靜脈注射MG53蛋白能夠透過血腦屏障,從而保護(hù)腦缺血性損傷。然而,目前有關(guān)重組人MG53蛋白聯(lián)合hUC-MSCs治療TBI的研究尚未見報(bào)道。此外,MG53蛋白能否單獨(dú)對損傷的神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用也未見報(bào)道。目的本課題旨在探究MG53蛋白對神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用以及其聯(lián)合hUC-MSCs對TBI小鼠的保護(hù)作用。建立脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞損傷模型,研究MG53蛋白對HT22增殖、凋亡、周期、遷移、抗氧化的影響及其分子機(jī)制。以TBI小鼠為研究對象,探討MG53蛋白聯(lián)合hUC-MSCs移植對TBI小鼠的治療作用和分子機(jī)制。方法第一部分研究MG53蛋白對LPS誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷的保護(hù)作用1、CCK-8法檢測細(xì)胞增殖,篩選LPS作用于HT22細(xì)胞的最佳濃度及時(shí)間。實(shí)驗(yàn)分為正常對照組(Normal Control,NC組)、MG53組、LPS組和MG53+LPS組。2、采用流式細(xì)胞術(shù)檢測MG53蛋白對HT22細(xì)胞周期與凋亡的影響。3、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測MG53蛋白對HT22細(xì)胞遷移的影響;ELISA檢測細(xì)胞SOD活力和MDA含量變化。4、qRT-PCR檢測MG53蛋白對HT22細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β、TLR4、MyD88和NF-κB mRNA表達(dá)的影響。5、Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin D1)及TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白等的表達(dá)變化。第二部分探討MG53蛋白聯(lián)合hUC-MSCs治療TBI的作用及機(jī)制1、C57BL/6小鼠建立TBI模型,隨機(jī)分為TBI組、MG53組、MSCs組和MG53+MSCs組。2、術(shù)后3天,PI染色檢測損傷部位皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞死亡情況,干濕重法檢測腦水腫情況。3、Western Blot檢測小鼠病灶部位MG53蛋白、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax以及促生存通路相關(guān)蛋白p-Akt1,p-GSK3β和p-ERK1/2的表達(dá)變化。4、免疫熒光檢測海馬區(qū)MAB1281表達(dá)情況,ELISA試劑盒檢測小鼠血清中SOD活力和MDA含量。5、術(shù)后1-28天,mNSS評估小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力;術(shù)后28天,新事物識別實(shí)驗(yàn)、糖水偏好實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)檢測小鼠的抑郁程度。6、CV染色檢測小鼠腦損傷體積,qRT-PCR檢測BDNF、NGF的表達(dá);術(shù)后14天、28天,免疫熒光檢測海馬區(qū)DCX、NeuN表達(dá)情況。結(jié)果第一部分MG53蛋白對LPS誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制初步研究1、CCK8結(jié)果顯示,LPS誘導(dǎo)對HT22細(xì)胞增殖具有濃度和時(shí)間依賴雙向效應(yīng),即低濃度水平促進(jìn)細(xì)胞增殖,高濃度水平抑制細(xì)胞增殖,引起細(xì)胞凋亡(P0.05),其中500mg/L LPS作用HT22細(xì)胞48 h后,細(xì)胞抑制率接近50%,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕ⅰ?、與LPS組相比,MG53+LPS組細(xì)胞存活率升高,凋亡率降低,G_0/G_1期減少,S期增加,遷移能力增加(P0.05)。Western Blot結(jié)果顯示,與LPS組相比,MG53+LPS組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)升高,Bax蛋白表達(dá)降低,Cyclin D1表達(dá)升高(P0.05)。3、ELISA結(jié)果顯示,與NC組相比,LPS組細(xì)胞SOD活性降低,MDA含量升高,與LPS組相比,MG53+LPS組細(xì)胞的SOD活性升高,MDA含量降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4、Western Blot結(jié)果顯示,與NC組相比,LPS組TNF-α,IL-6和IL-1β蛋白表達(dá)上調(diào)(P0.05),TLR4/NF-κB信號通路中總的NF-κB p65蛋白表達(dá)無顯著變化(P0.05),IKBα蛋白表達(dá)水平降低(P0.05),TLR4,p-NF-κB p65,p-IKBα蛋白表達(dá)升高(P0.05);與LPS組相比,LPS+MG53組TNF-α,IL-6,IL-1β蛋白表達(dá)水平降低(P0.05),總的NF-κB p65表達(dá)無顯著變化(P0.05),IKBα表達(dá)升高,TLR4,p-NF-κB p65,p-IKBα蛋白表達(dá)降低(P0.05),qRT-PCR的結(jié)果與Western Blot的結(jié)果一致(P0.05)。第二部分MG53蛋白聯(lián)合hUC-MSCs治療小鼠創(chuàng)傷性腦損傷1、術(shù)后3天,與TBI組相比,各治療組小鼠的大腦病灶側(cè)含水量明顯降低,聯(lián)合治療組小鼠腦含水量最低(P0.05),病灶對側(cè)腦含水量無顯著差異(P0.05);與TBI組相比,各治療組小鼠的大腦皮質(zhì)PI陽性細(xì)胞減少,抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)升高,促凋亡蛋白Bax表達(dá)降低,而聯(lián)合治療組變化最明顯(P0.05)。2、免疫熒光結(jié)果顯示,MSCs組和MG53+MSCs組能夠檢測到MAB1281陽性細(xì)胞,TBI組和MG53組未檢測到MAB1281陽性細(xì)胞;與TBI組相比,各治療組小鼠血清中自由基清除劑SOD活力升高,氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA含量降低,且聯(lián)合治療組的效果更明顯(P0.05)。3、Western結(jié)果顯示,MG53組和MG53+MSCs組能夠檢測到MG53蛋白,而TBI組和MSCs組未檢測到MG53蛋白;與TBI組相比,MG53組p-Akt1和p-ERK1/2的表達(dá)顯著升高(P0.05),p-GSK3β無顯著變化(P0.05),MSCs組和MG53+MSCs組的p-Akt1,p-GSK3β和p-ERK1/2的表達(dá)均顯著升高(P0.05),而且聯(lián)合治療組變化更明顯(P0.05),但是總的Akt1,GSK3β和ERK1/2的表達(dá)沒有顯著變化(P0.05),提示MG53蛋白和hUC-MSCs可能是通過調(diào)控PI3K/Akt-GSK3β和ERK1/2信號通路對腦損傷小鼠起保護(hù)作用。4、術(shù)后各組小鼠體重在1天、3天減輕,從7天開始增加。術(shù)后7天后,與TBI組相比,各治療組小鼠體重明顯增加,mNSS評分明顯降低,且聯(lián)合治療組小鼠體重增加最快,mNSS評分最低(P0.05);與TBI組相比,各治療組小鼠穿越平臺次數(shù)增加,平臺所在象限停留時(shí)間增加,逃避潛伏期時(shí)間縮短,懸浮時(shí)間減少,辨別指數(shù)和糖水偏好度均顯著提高(P0.05),且聯(lián)合治療組的效果更明顯(P0.05)。5、與TBI組相比,各治療組小鼠神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF mRNA表達(dá)升高(P0.05),且聯(lián)合治療組表達(dá)最高(P0.05);免疫熒光結(jié)果顯示,與TBI組相比,各治療組小鼠海馬區(qū)DCX和NeuN陽性細(xì)胞增加(P0.05),聯(lián)合治療組陽性細(xì)胞數(shù)增加更顯著(P0.05)。結(jié)論1、MG53蛋白能夠促使LPS損傷的HT22細(xì)胞存活,抑制細(xì)胞凋亡,促使細(xì)胞從G0/G1期向S期運(yùn)轉(zhuǎn),提高細(xì)胞遷移力和抗氧化能力,抑制TLR4/NF-κB信號通路,降低LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。2、MG53蛋白和hUC-MSCs能夠透過血腦屏障遷移到TBI小鼠損傷部位,治療后能夠增加小鼠體重,改善認(rèn)知功能,增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力,提高神經(jīng)恢復(fù),減輕抑郁,抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)神經(jīng)再生,提高抗氧化水平,而且聯(lián)合治療比單一治療效果更加明顯。此外,MG53蛋白和hUC-MSCs可能通過激活PI3K/Akt-GSK3β和ERK1/2信號通路對TBI小鼠發(fā)揮保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R651.15
【圖文】：

不同濃度LPS處理的HT22A：正常培養(yǎng)48h的HT22(200×)，B：500mg/L的LPS處理48h的HT22(200×)，C：

MG53對LPS損傷的HT22細(xì)胞存活率的影響

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2725849