【摘要】：創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)是一種常見的由于外力引起腦部神經(jīng)功能障礙和神經(jīng)細胞死亡的損傷性疾病,能夠導致嚴重的生理、心理以及認知功能方面障礙。為了有效治療TBI,迫切需要一種新型的治療方法。干細胞與再生醫(yī)學的出現(xiàn)為TBI治療提供新的思路。研究發(fā)現(xiàn),干細胞移植可以通過旁分泌和細胞替代途徑對TBI發(fā)揮保護作用。人臍帶間充質干細胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)具有更新速度快、低免疫原性和畸胎瘤形成風險低等特點,具有潛在的應用價值。TBI損傷之后由于組織缺血和炎癥反應會導致產(chǎn)生大量的活性氧,引起組織病理和細胞死亡,阻礙移植后細胞的遷移和存活。MG53蛋白(Mitsugumin53 protein,MG53)是TRIM(Tripartite motif,TRIM)家族蛋白成員之一,也是細胞膜修復中的重要組成部分。在嚙齒類動物和大多數(shù)動物模型中,MG53蛋白可以保護多種細胞膜免受破壞,同時也能改善肌營養(yǎng)不良、急性肺損傷、心肌梗死和急性腎臟損傷等疾病,而且靜脈注射MG53蛋白能夠透過血腦屏障,從而保護腦缺血性損傷。然而,目前有關重組人MG53蛋白聯(lián)合hUC-MSCs治療TBI的研究尚未見報道。此外,MG53蛋白能否單獨對損傷的神經(jīng)元細胞發(fā)揮保護作用也未見報道。目的本課題旨在探究MG53蛋白對神經(jīng)元細胞的保護作用以及其聯(lián)合hUC-MSCs對TBI小鼠的保護作用。建立脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導的小鼠海馬神經(jīng)元HT22細胞損傷模型,研究MG53蛋白對HT22增殖、凋亡、周期、遷移、抗氧化的影響及其分子機制。以TBI小鼠為研究對象,探討MG53蛋白聯(lián)合hUC-MSCs移植對TBI小鼠的治療作用和分子機制。方法第一部分研究MG53蛋白對LPS誘導的HT22細胞損傷的保護作用1、CCK-8法檢測細胞增殖,篩選LPS作用于HT22細胞的最佳濃度及時間。實驗分為正常對照組(Normal Control,NC組)、MG53組、LPS組和MG53+LPS組。2、采用流式細胞術檢測MG53蛋白對HT22細胞周期與凋亡的影響。3、劃痕實驗檢測MG53蛋白對HT22細胞遷移的影響;ELISA檢測細胞SOD活力和MDA含量變化。4、qRT-PCR檢測MG53蛋白對HT22細胞TNF-α、IL-6、IL-1β、TLR4、MyD88和NF-κB mRNA表達的影響。5、Western Blot檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、細胞周期蛋白(Cyclin D1)及TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白等的表達變化。第二部分探討MG53蛋白聯(lián)合hUC-MSCs治療TBI的作用及機制1、C57BL/6小鼠建立TBI模型,隨機分為TBI組、MG53組、MSCs組和MG53+MSCs組。2、術后3天,PI染色檢測損傷部位皮質區(qū)細胞死亡情況,干濕重法檢測腦水腫情況。3、Western Blot檢測小鼠病灶部位MG53蛋白、凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax以及促生存通路相關蛋白p-Akt1,p-GSK3β和p-ERK1/2的表達變化。4、免疫熒光檢測海馬區(qū)MAB1281表達情況,ELISA試劑盒檢測小鼠血清中SOD活力和MDA含量。5、術后1-28天,mNSS評估小鼠神經(jīng)功能恢復情況、Morris水迷宮實驗檢測小鼠學習記憶能力;術后28天,新事物識別實驗、糖水偏好實驗和強迫游泳實驗檢測小鼠的抑郁程度。6、CV染色檢測小鼠腦損傷體積,qRT-PCR檢測BDNF、NGF的表達;術后14天、28天,免疫熒光檢測海馬區(qū)DCX、NeuN表達情況。結果第一部分MG53蛋白對LPS誘導的HT22細胞損傷的保護作用及其機制初步研究1、CCK8結果顯示,LPS誘導對HT22細胞增殖具有濃度和時間依賴雙向效應,即低濃度水平促進細胞增殖,高濃度水平抑制細胞增殖,引起細胞凋亡(P0.05),其中500mg/L LPS作用HT22細胞48 h后,細胞抑制率接近50%,用于后續(xù)實驗模型的建立。2、與LPS組相比,MG53+LPS組細胞存活率升高,凋亡率降低,G_0/G_1期減少,S期增加,遷移能力增加(P0.05)。Western Blot結果顯示,與LPS組相比,MG53+LPS組細胞中Bcl-2蛋白表達升高,Bax蛋白表達降低,Cyclin D1表達升高(P0.05)。3、ELISA結果顯示,與NC組相比,LPS組細胞SOD活性降低,MDA含量升高,與LPS組相比,MG53+LPS組細胞的SOD活性升高,MDA含量降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4、Western Blot結果顯示,與NC組相比,LPS組TNF-α,IL-6和IL-1β蛋白表達上調(P0.05),TLR4/NF-κB信號通路中總的NF-κB p65蛋白表達無顯著變化(P0.05),IKBα蛋白表達水平降低(P0.05),TLR4,p-NF-κB p65,p-IKBα蛋白表達升高(P0.05);與LPS組相比,LPS+MG53組TNF-α,IL-6,IL-1β蛋白表達水平降低(P0.05),總的NF-κB p65表達無顯著變化(P0.05),IKBα表達升高,TLR4,p-NF-κB p65,p-IKBα蛋白表達降低(P0.05),qRT-PCR的結果與Western Blot的結果一致(P0.05)。第二部分MG53蛋白聯(lián)合hUC-MSCs治療小鼠創(chuàng)傷性腦損傷1、術后3天,與TBI組相比,各治療組小鼠的大腦病灶側含水量明顯降低,聯(lián)合治療組小鼠腦含水量最低(P0.05),病灶對側腦含水量無顯著差異(P0.05);與TBI組相比,各治療組小鼠的大腦皮質PI陽性細胞減少,抑凋亡蛋白Bcl-2表達升高,促凋亡蛋白Bax表達降低,而聯(lián)合治療組變化最明顯(P0.05)。2、免疫熒光結果顯示,MSCs組和MG53+MSCs組能夠檢測到MAB1281陽性細胞,TBI組和MG53組未檢測到MAB1281陽性細胞;與TBI組相比,各治療組小鼠血清中自由基清除劑SOD活力升高,氧化應激產(chǎn)物MDA含量降低,且聯(lián)合治療組的效果更明顯(P0.05)。3、Western結果顯示,MG53組和MG53+MSCs組能夠檢測到MG53蛋白,而TBI組和MSCs組未檢測到MG53蛋白;與TBI組相比,MG53組p-Akt1和p-ERK1/2的表達顯著升高(P0.05),p-GSK3β無顯著變化(P0.05),MSCs組和MG53+MSCs組的p-Akt1,p-GSK3β和p-ERK1/2的表達均顯著升高(P0.05),而且聯(lián)合治療組變化更明顯(P0.05),但是總的Akt1,GSK3β和ERK1/2的表達沒有顯著變化(P0.05),提示MG53蛋白和hUC-MSCs可能是通過調控PI3K/Akt-GSK3β和ERK1/2信號通路對腦損傷小鼠起保護作用。4、術后各組小鼠體重在1天、3天減輕,從7天開始增加。術后7天后,與TBI組相比,各治療組小鼠體重明顯增加,mNSS評分明顯降低,且聯(lián)合治療組小鼠體重增加最快,mNSS評分最低(P0.05);與TBI組相比,各治療組小鼠穿越平臺次數(shù)增加,平臺所在象限停留時間增加,逃避潛伏期時間縮短,懸浮時間減少,辨別指數(shù)和糖水偏好度均顯著提高(P0.05),且聯(lián)合治療組的效果更明顯(P0.05)。5、與TBI組相比,各治療組小鼠神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF mRNA表達升高(P0.05),且聯(lián)合治療組表達最高(P0.05);免疫熒光結果顯示,與TBI組相比,各治療組小鼠海馬區(qū)DCX和NeuN陽性細胞增加(P0.05),聯(lián)合治療組陽性細胞數(shù)增加更顯著(P0.05)。結論1、MG53蛋白能夠促使LPS損傷的HT22細胞存活,抑制細胞凋亡,促使細胞從G0/G1期向S期運轉,提高細胞遷移力和抗氧化能力,抑制TLR4/NF-κB信號通路,降低LPS誘導的炎癥反應。2、MG53蛋白和hUC-MSCs能夠透過血腦屏障遷移到TBI小鼠損傷部位,治療后能夠增加小鼠體重,改善認知功能,增強學習記憶能力,提高神經(jīng)恢復,減輕抑郁,抑制細胞凋亡,促進神經(jīng)再生,提高抗氧化水平,而且聯(lián)合治療比單一治療效果更加明顯。此外,MG53蛋白和hUC-MSCs可能通過激活PI3K/Akt-GSK3β和ERK1/2信號通路對TBI小鼠發(fā)揮保護作用。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R651.15
【圖文】：

不同濃度LPS處理的HT22A：正常培養(yǎng)48h的HT22(200×)，B：500mg/L的LPS處理48h的HT22(200×)，C：

MG53對LPS損傷的HT22細胞存活率的影響

【參考文獻】

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本文編號：2725849