【摘要】：目的:研究嗎啡預(yù)處理對神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor,NGF)誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞瞬態(tài)電壓感受器離子通道1(Transient receptor potential vanilloid1,TRPV1)敏化的抑制作用及信號(hào)通路,以探討其調(diào)控心肌缺血傷害感受信號(hào)傳導(dǎo)的可能機(jī)制。方法:原代培養(yǎng)2日齡SD大鼠背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglia,DRG)神經(jīng)元或大鼠嗜鉻瘤細(xì)胞(Pheochromocytoma cell,PC12),接種于24孔板或6孔板中,均隨機(jī)分為8組:對照組(CON組)、辣椒素刺激組(CAP組)、NGF敏化組(NGF組)、不同濃度嗎啡預(yù)處理組(MPC0.3組、MPC1.0組、MPC3.0組)、TRPV1通道阻斷劑組(I-RTX組)、TRPV1阻斷劑+NGF敏化組(I-RTX+NGF組)。CON組細(xì)胞正常培養(yǎng),CAP組細(xì)胞予以100nmol/L辣椒素刺激,NGF組細(xì)胞加入100ng/m L NGF孵育1h,不同濃度MPC組細(xì)胞于NGF孵育前分別予以終濃度為0.3、1.0、3.0?mol/L的含嗎啡培養(yǎng)液孵育10分鐘,洗脫30分鐘,I-RTX組及I-RTX+NGF組細(xì)胞分別在CAP組及NGF組細(xì)胞的基礎(chǔ)上予以100nmol/L I-RTX共同孵育。各組DRG神經(jīng)元在100nmol/L辣椒素刺激后,即刻采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測辣椒素誘發(fā)內(nèi)向電流;免疫熒光雙標(biāo)染色法觀察P物質(zhì)(Substance P,SP)及降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)蛋白共表達(dá)情況;各組PC12細(xì)胞均予以Western blot法檢測TRPV1、磷酸化TRPV1(Phosphorylated TRPV1,p TRPV1)、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(Phosphorylated extracellular signal-regulated kinase1/2,p ERK1/2)及磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylated protein kinase B,p AKT)相對表達(dá)水平。結(jié)果:DRG神經(jīng)元膜片鉗結(jié)果顯示,與CON組比較,CAP組的辣椒素誘發(fā)內(nèi)向電流幅度增加(P0.05),而I-RTX可以抑制其電流幅度(P0.05);與CAP組比較,NGF組辣椒素誘發(fā)內(nèi)向電流振幅增加(P0.05),而各濃度嗎啡預(yù)處理組及I-RTX均可以對其產(chǎn)生抑制作用(P0.05)。免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果表明,SP及CGRP在DRG神經(jīng)元中存在共表達(dá),與CAP組相比,NGF組可見SP及CGRP蛋白由神經(jīng)元胞體轉(zhuǎn)向突觸的表達(dá)增加,而嗎啡預(yù)處理可以抑制這種表達(dá);I-RTX+NGF組SP及CGRP共表達(dá)量較其他各組均明顯減少。PC12神經(jīng)細(xì)胞Western blot結(jié)果顯示,與CON組相比,CAP組TRPV1蛋白、p TRPV1蛋白、p ERK1/2蛋白及p AKT蛋白表達(dá)均上調(diào)(P0.05),而I-RTX可以抑制其上調(diào)(P0.05);NGF刺激可進(jìn)一步增加TRPV1蛋白、p TRPV1蛋白以及p ERK1/2與p AKT蛋白表達(dá)水平(P0.05),但TRPV1阻斷劑I-RTX可抑制上述蛋白表達(dá)(P0.05)。與NGF組相比,各濃度MPC組p ERK1/2、p AKT、p TRPV1表達(dá)均下調(diào)(P0.05)。結(jié)論:NGF可誘導(dǎo)神經(jīng)元TRPV1通道敏化,并激活其下游的ERK1/2及AKT信號(hào)通路,引起神經(jīng)元肽類物質(zhì)的釋放;嗎啡預(yù)處理可能通過抑制NGF誘導(dǎo)的TRPV1通道敏化及下游信號(hào)通路活化,調(diào)控心肌缺血傷害感受信號(hào)的傳導(dǎo)。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R614
【圖文】：

圖 1：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組示意圖：CON 組與 CAP 組細(xì)胞正常培養(yǎng)，NGF 組細(xì)胞予以含 NGF 100ng/mL 的神經(jīng)元培養(yǎng)基培養(yǎng) 1h，不同濃度 MPC 組細(xì)胞于 NGF 培養(yǎng)前分別予以終濃度為 0.3、1.0、3.0 mol/L 的含嗎啡的神經(jīng)元培養(yǎng)液孵育 10 分鐘后，換用無嗎啡培養(yǎng)基培養(yǎng) 30 分鐘。進(jìn)過上述處理后，CON 組細(xì)胞直接采用單細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測細(xì)胞膜電流變化，兩抑制劑組細(xì)胞先予以終濃度 100nmol/L I-RTX 單獨(dú)作用 20s，再與100nmol/L 辣椒素共同處理，即刻采用單細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測細(xì)胞膜電流變化。其余 5 組 DRG 神經(jīng)元均予以100nmol/L 辣椒素刺激，即刻記錄細(xì)胞電流變化。其中，CON 組、CAP 組、NGF 組、MPC1.0 組、I-RTX+NGF組 5 組 DRG 神經(jīng)元中，隨機(jī)選取一孔細(xì)胞用于免疫熒光雙標(biāo)染色，CON 組及 CAP 組細(xì)胞正常培養(yǎng)，NGF組細(xì)胞加入 100ng/mL NGF 培養(yǎng) 1h，MPC 組細(xì)胞于 NGF 培養(yǎng)前予以終濃度為 1.0 mol/L 的含嗎啡神經(jīng)元培養(yǎng)液孵育 10 分鐘后，再換為無嗎啡的神經(jīng)元培養(yǎng)液培養(yǎng) 30 分鐘，I-RTX+NGF 組于 NGF 孵育前予以含100nmol/L I-RTX 神經(jīng)元培養(yǎng)液孵育 10 分鐘。上述處理后，除去 CON 組外，各組 DRG 神經(jīng)元均予以 100nmol/L辣椒素孵育 30 分鐘后，用于免疫熒光雙標(biāo)染色。

圖 2：分子實(shí)驗(yàn)分組圖示：CON 組及 CAP 組細(xì)胞正常培養(yǎng)，NGF 組細(xì)胞加入 100ng/mL NGF 培養(yǎng) 1h，不同濃度 MPC 組細(xì)胞于 NGF 培養(yǎng)前分別予以終濃度為 0.3、1.0、3.0 mol/L 的含嗎啡的高糖 DMEM 培養(yǎng)液孵育10 分鐘后，再換為無嗎啡的培養(yǎng)基培養(yǎng) 30 分鐘。I-RTX 組予以含終濃度 100nmol/L I-RTX 的高糖 DMEM 孵育 10 分鐘，I-RTX+NGF 組于 NGF 孵育前予以含 100nmol/L I-RTX 培養(yǎng)基孵育 10 分鐘。上述處理后，除去CON 組外，各組 PC12 細(xì)胞均予以 100nmol/L 辣椒素孵育 30 分鐘后，收集細(xì)胞蛋白用于 Western blot 法檢測。Fig 2. The group schematic diagram of molecule experiment. The cells in group CON were cultured in normalculture condition, and the cells in group CAP were stimulated by 100nmol/L capsaicin while in group NGF the cellswere treated with 100nmol/L NGF for 1 hour. In addition, in group MPC0.3, MPC1.0 and MPC3.0, the cells werepretreated with 0.3μmol/L, 1.0μmol/L or 3.0μmol/L morphine for 10min, followed by wash-out for 30min,respectively, prior to the addition of NGF. Meanwhile, the cells in group I-RTX and I-RTX+NGF were stimulated by100nmol/L I-RTX for 20 second, followed by the co-stimulation of 100nmol/L capsaicin and I-RTX. Afterwards, the

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 許士進(jìn);何淑芳;胡軍;黃成;張野;;鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理對心肌缺血再灌注大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)生長因子表達(dá)的影響[J];中華麻醉學(xué)雜志;2016年06期

本文編號(hào)：2720298