【摘要】：第一部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及ASICla在大鼠椎間盤髓核中的表達目的:探索大鼠椎間盤髓核組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和ASICla的表達及其與退變的關系。方法:獲取大鼠4周、8周、12周、24周、40周、60周共6個時間點大鼠脊柱正中冠狀面切片。HE染色觀察細胞成分及形態(tài)演變,阿利辛藍、天狼星紅染色觀察軟骨基質(zhì)與纖維基質(zhì)表達變化,馬松染色觀察肌纖維與膠原纖維表達變化。免疫組織化學染色觀察ASICla、GRP78、XBP1、eIF2a、CHOP和Caspase12表達分布。8周SD大鼠穿刺誘導椎間盤退變,術后8周行MRI觀察造模情況,Western blot、qRT-PCR比較正常及退變椎間盤髓核中ASICla、GRP78、XBP1、CHOP和Caspase12的表達情況。結果:自然退變過程中,隨年齡增長,椎間盤髓核中細胞數(shù)目逐漸減少,膠原纖維和蛋白多糖含量逐漸降低。自然退變過程中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激代表性指標GRP78、XBP1、p-eIF2a、CHOP和Caspase12在椎間盤髓核中均有表達。其中GRP78、XBP1和p-eIF2a在年輕椎間盤中表達較高,隨退變進展表達逐漸降低。CHOP和Caspase12表達在年輕椎間盤表達較低,退變后表達較高,但嚴重退變后表達再次降低。ASICla表達在40周前呈現(xiàn)逐漸上升趨勢,60周時表達明顯下降。穿刺誘導退變的大鼠椎間盤髓核中,GRP78、XBP1和p-eIF2a表達降低,CHOP和ASICla表達增加,Capsase12表達無明顯變化。結論:1.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激參與了大鼠椎間盤髓核退變過程,包括UPR反應相關指標和促凋亡通路指標在椎間盤髓核中均有表達,其中UPR的表達和髓核功能相關。2.ASICla在大鼠椎間盤髓核中表達,退變過程中ASICla的表達逐漸增加,嚴重退變的髓核組織中ASICla表達降低。第二部分酸誘導的大鼠NPCs損傷與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激目的:體外模擬椎間盤酸性環(huán)境,檢測酸刺激對NPCs的影響,探索酸性環(huán)境中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激活化及功能。方法:不同pH值培養(yǎng)不同時間,模擬椎間盤酸性微環(huán)境,建立酸誘導的髓核細胞損傷模型。CCK-8檢測細胞增殖,流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期。Western blot檢測衰老、自噬、凋亡蛋白表達情況。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激特異性阻斷劑4-PBA用于阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。透射電鏡觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結構變化。采用qRT-PCR、Western blot、細胞免疫熒光法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的表達活化。結果:急性酸刺激激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,并誘導髓核細胞自噬、老化和凋亡。輕微酸刺激(pH7.0)時,髓核細胞增殖速度加快,而衰老和凋亡相關指標無明顯變化,持續(xù)延長的酸刺激能降低NPCs活力和增殖能力,并誘導NPCs衰老、凋亡。在pH7.4時,NPCs中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關指標表達較低,輕微酸刺激(pH7.0)即可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和UPR反應,嚴重酸刺激(pH6.5)活化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中促凋亡通路。4-PBA能夠降低酸活化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,降低自噬并顯著加劇酸誘導的細胞凋亡和G1期停滯(p0.05)。結論:NPCs具有一定的酸抗性。急性酸刺激能夠誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在急性酸刺激中主要起抗凋亡和衰老的保護性作用,是髓核細胞酸抗性的重要組成部分,嚴重酸刺激能夠?qū)е聝?nèi)質(zhì)網(wǎng)應激特異性凋亡。第三部分ASICla的活化與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的偶聯(lián)關系目的:檢測酸刺激下NPCs中ASICla的表達和激活,探索ASICla的激活與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的偶聯(lián)關系。方法:模擬椎間盤的酸性環(huán)境,采用Western blot、免疫熒光檢測ASICla在正常大鼠椎間盤髓核細胞中的表達情況。構建siRNA干擾ASICla的NPCs。采用Fura-2/AM熒光探針檢測ASICla在酸性環(huán)境中的活化,CCK8法、Ki67免疫熒光染色評價ASICla活化對NPCs活力和增殖的影響,流式細胞術檢測ASICla活化對NPCs凋亡的影響,qPCR、Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的表達變化情況。結果:(1)正常NPCs中少量表達ASICla,酸刺激能夠誘導ASICla表達上調(diào),在一定時間范圍內(nèi),ASICla的表達隨酸度增加、刺激時間延長而增加。酸度過大或酸處理時間過長,均會導致ASICla表達下降。(2)在pH 7.4時,細胞內(nèi)Ca2+濃度處于一個穩(wěn)定的較低的基線值,pH6.5的酸性溶液刺激能夠活化NPCs表面的ASICla,使細胞膜對Ca2+通透性顯著上升,導致Ca2+內(nèi)流明顯增加。在不含Ca2+的培養(yǎng)體系或阻斷ASICla后均可以降低Ca2+內(nèi)流。(3)CCK8、Ki67及流式細胞術結果提示酸刺激能夠降低NPCs活力和增殖能力,誘導髓核細胞凋亡。阻斷ASICla能夠降低酸誘導的髓核細胞凋亡,4-PBA能夠使之反轉(zhuǎn)。(5)4-PBA能夠明顯降低酸誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白標志物表達,包括GRP78、CHOP和Caspasel2,并降低eIF2 a的磷酸化水平和XBP1的剪切修飾。阻斷ASICla能夠降低酸誘導上升的GRP78、CHOP和Caspase12在mRNA和蛋白水平的表達,部分降低eIF2a的磷酸化水平,對XBP1的剪切無明顯影響。結論:酸刺激能夠誘導ASICla的表達及活化,激活后的ASCIla能引起細胞膜對Ca2+通透性大幅增加,導致細胞鈣超載而損傷。阻斷ASICla能夠顯著增加酸刺激下NPCs存活率和增殖活力,部分降低酸誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激活化,對UPR影響較小,提示ASICla是良好的治療靶點。
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R681.53
【圖文】：

時髓核細胞數(shù)目達到頂峰，髓核區(qū)域內(nèi)含有大量的膠原纖維和蛋白多糖成分。４０周逡逑時，髓核細胞數(shù)目明顯下降，６０周時髓核組織形態(tài)不清晰，髓核細胞數(shù)目大幅降低，逡逑細胞多數(shù)聚集成團，膠原纖維和蛋白多糖成分含量明顯降低。（圖１－２，邋１－３，邋１－４）逡逑３５逡逑

示隨年齡增長，ＡＳＩＣｌａ的表達存在先升高后下降的趨勢。４周－８周時，ＡＳＩＣｌａ表達率逡逑較低，１２－２４周時ＡＳＩＣｌａ表達增高，以４０周為代表的中年鼠椎間盤中ＡＳＩＣｌａ達到表達逡逑高峰，６０周時出現(xiàn)明顯下降。（圖１－５，＊ｐ＜０．邋０５，＃ｐ＜０．邋０１）逡逑３７逡逑

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