【摘要】：第一部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及ASICla在大鼠椎間盤髓核中的表達(dá)目的:探索大鼠椎間盤髓核組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和ASICla的表達(dá)及其與退變的關(guān)系。方法:獲取大鼠4周、8周、12周、24周、40周、60周共6個時間點大鼠脊柱正中冠狀面切片。HE染色觀察細(xì)胞成分及形態(tài)演變,阿利辛藍(lán)、天狼星紅染色觀察軟骨基質(zhì)與纖維基質(zhì)表達(dá)變化,馬松染色觀察肌纖維與膠原纖維表達(dá)變化。免疫組織化學(xué)染色觀察ASICla、GRP78、XBP1、eIF2a、CHOP和Caspase12表達(dá)分布。8周SD大鼠穿刺誘導(dǎo)椎間盤退變,術(shù)后8周行MRI觀察造模情況,Western blot、qRT-PCR比較正常及退變椎間盤髓核中ASICla、GRP78、XBP1、CHOP和Caspase12的表達(dá)情況。結(jié)果:自然退變過程中,隨年齡增長,椎間盤髓核中細(xì)胞數(shù)目逐漸減少,膠原纖維和蛋白多糖含量逐漸降低。自然退變過程中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激代表性指標(biāo)GRP78、XBP1、p-eIF2a、CHOP和Caspase12在椎間盤髓核中均有表達(dá)。其中GRP78、XBP1和p-eIF2a在年輕椎間盤中表達(dá)較高,隨退變進(jìn)展表達(dá)逐漸降低。CHOP和Caspase12表達(dá)在年輕椎間盤表達(dá)較低,退變后表達(dá)較高,但嚴(yán)重退變后表達(dá)再次降低。ASICla表達(dá)在40周前呈現(xiàn)逐漸上升趨勢,60周時表達(dá)明顯下降。穿刺誘導(dǎo)退變的大鼠椎間盤髓核中,GRP78、XBP1和p-eIF2a表達(dá)降低,CHOP和ASICla表達(dá)增加,Capsase12表達(dá)無明顯變化。結(jié)論:1.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了大鼠椎間盤髓核退變過程,包括UPR反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)和促凋亡通路指標(biāo)在椎間盤髓核中均有表達(dá),其中UPR的表達(dá)和髓核功能相關(guān)。2.ASICla在大鼠椎間盤髓核中表達(dá),退變過程中ASICla的表達(dá)逐漸增加,嚴(yán)重退變的髓核組織中ASICla表達(dá)降低。第二部分酸誘導(dǎo)的大鼠NPCs損傷與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激目的:體外模擬椎間盤酸性環(huán)境,檢測酸刺激對NPCs的影響,探索酸性環(huán)境中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激活化及功能。方法:不同pH值培養(yǎng)不同時間,模擬椎間盤酸性微環(huán)境,建立酸誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞損傷模型。CCK-8檢測細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。Western blot檢測衰老、自噬、凋亡蛋白表達(dá)情況。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性阻斷劑4-PBA用于阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。透射電鏡觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)變化。采用qRT-PCR、Western blot、細(xì)胞免疫熒光法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的表達(dá)活化。結(jié)果:急性酸刺激激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,并誘導(dǎo)髓核細(xì)胞自噬、老化和凋亡。輕微酸刺激(pH7.0)時,髓核細(xì)胞增殖速度加快,而衰老和凋亡相關(guān)指標(biāo)無明顯變化,持續(xù)延長的酸刺激能降低NPCs活力和增殖能力,并誘導(dǎo)NPCs衰老、凋亡。在pH7.4時,NPCs中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)表達(dá)較低,輕微酸刺激(pH7.0)即可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR反應(yīng),嚴(yán)重酸刺激(pH6.5)活化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中促凋亡通路。4-PBA能夠降低酸活化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,降低自噬并顯著加劇酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和G1期停滯(p0.05)。結(jié)論:NPCs具有一定的酸抗性。急性酸刺激能夠誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在急性酸刺激中主要起抗凋亡和衰老的保護(hù)性作用,是髓核細(xì)胞酸抗性的重要組成部分,嚴(yán)重酸刺激能夠?qū)е聝?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性凋亡。第三部分ASICla的活化與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的偶聯(lián)關(guān)系目的:檢測酸刺激下NPCs中ASICla的表達(dá)和激活,探索ASICla的激活與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的偶聯(lián)關(guān)系。方法:模擬椎間盤的酸性環(huán)境,采用Western blot、免疫熒光檢測ASICla在正常大鼠椎間盤髓核細(xì)胞中的表達(dá)情況。構(gòu)建siRNA干擾ASICla的NPCs。采用Fura-2/AM熒光探針檢測ASICla在酸性環(huán)境中的活化,CCK8法、Ki67免疫熒光染色評價ASICla活化對NPCs活力和增殖的影響,流式細(xì)胞術(shù)檢測ASICla活化對NPCs凋亡的影響,qPCR、Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的表達(dá)變化情況。結(jié)果:(1)正常NPCs中少量表達(dá)ASICla,酸刺激能夠誘導(dǎo)ASICla表達(dá)上調(diào),在一定時間范圍內(nèi),ASICla的表達(dá)隨酸度增加、刺激時間延長而增加。酸度過大或酸處理時間過長,均會導(dǎo)致ASICla表達(dá)下降。(2)在pH 7.4時,細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度處于一個穩(wěn)定的較低的基線值,pH6.5的酸性溶液刺激能夠活化NPCs表面的ASICla,使細(xì)胞膜對Ca2+通透性顯著上升,導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流明顯增加。在不含Ca2+的培養(yǎng)體系或阻斷ASICla后均可以降低Ca2+內(nèi)流。(3)CCK8、Ki67及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示酸刺激能夠降低NPCs活力和增殖能力,誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡。阻斷ASICla能夠降低酸誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡,4-PBA能夠使之反轉(zhuǎn)。(5)4-PBA能夠明顯降低酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白標(biāo)志物表達(dá),包括GRP78、CHOP和Caspasel2,并降低eIF2 a的磷酸化水平和XBP1的剪切修飾。阻斷ASICla能夠降低酸誘導(dǎo)上升的GRP78、CHOP和Caspase12在mRNA和蛋白水平的表達(dá),部分降低eIF2a的磷酸化水平,對XBP1的剪切無明顯影響。結(jié)論:酸刺激能夠誘導(dǎo)ASICla的表達(dá)及活化,激活后的ASCIla能引起細(xì)胞膜對Ca2+通透性大幅增加,導(dǎo)致細(xì)胞鈣超載而損傷。阻斷ASICla能夠顯著增加酸刺激下NPCs存活率和增殖活力,部分降低酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激活化,對UPR影響較小,提示ASICla是良好的治療靶點。
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R681.53
【圖文】：

時髓核細(xì)胞數(shù)目達(dá)到頂峰，髓核區(qū)域內(nèi)含有大量的膠原纖維和蛋白多糖成分。４０周逡逑時，髓核細(xì)胞數(shù)目明顯下降，６０周時髓核組織形態(tài)不清晰，髓核細(xì)胞數(shù)目大幅降低，逡逑細(xì)胞多數(shù)聚集成團(tuán)，膠原纖維和蛋白多糖成分含量明顯降低。（圖１－２，邋１－３，邋１－４）逡逑３５逡逑

示隨年齡增長，ＡＳＩＣｌａ的表達(dá)存在先升高后下降的趨勢。４周－８周時，ＡＳＩＣｌａ表達(dá)率逡逑較低，１２－２４周時ＡＳＩＣｌａ表達(dá)增高，以４０周為代表的中年鼠椎間盤中ＡＳＩＣｌａ達(dá)到表達(dá)逡逑高峰，６０周時出現(xiàn)明顯下降。（圖１－５，＊ｐ＜０．邋０５，＃ｐ＜０．邋０１）逡逑３７逡逑

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本文編號：2713379