【摘要】：穿支皮瓣移植是修復(fù)各種腫瘤(乳腺腫瘤、頭頸部腫瘤及黑色素瘤)切除后、外傷、各種慢性病(糖尿病足、褥瘡)以及先天畸形所造成的皮膚軟組織缺損最為常用的手術(shù)方法。盡管隨著顯微外科技術(shù)的發(fā)展以及解剖知識的完善,穿支皮瓣移植的壞死率已大大降低,但穿支皮瓣遠(yuǎn)端的部分壞死仍然是當(dāng)今整形外科面臨的一個重要難題。皮瓣壞死不僅給患者帶來了沉重的心理壓力,而且增加了住院時間以及經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。當(dāng)前的研究表明不充足的血液供應(yīng)以及缺血再灌注損傷是穿支皮瓣壞死的主要因素,因此尋求解決這些問題的方法尤為重要。皮瓣的外科延遲是當(dāng)前研究時間最長,同時也是臨床上已經(jīng)被證實可以有效改善皮瓣存活率的一種方法。雖然其作用機制仍未完全明確,但許多細(xì)胞因子如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor beta,TGF-β)以及胎盤生長因子(Placeta Growth Factor,PIGF)均被證實能有效改善皮瓣的存活能力,其中,以VEGF的作用效果最為明顯。VEGF是一種強有力的促血管生成的細(xì)胞生長因子,在機體的正常生理和病理條件下均發(fā)揮著重要的作用,其效應(yīng)主要有促進內(nèi)皮細(xì)胞增殖以及血管發(fā)生、促進炎癥以及增加血管通透性等。目前有關(guān)VEGF改善皮瓣存活能力的大部分研究都是通過將外源性的VEGF注射到皮瓣模型中進行研究的,對于皮瓣外科延遲中產(chǎn)生的內(nèi)源性VEGF的作用目前仍不清楚。阿西替尼(Axitinib)是一種有效的、選擇性的抑制血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)酪氨酸激酶的二代抑制劑,能有效抑制內(nèi)源性VEGF的產(chǎn)生。目前其抑制各種實質(zhì)性腫瘤的作用已經(jīng)被證實,但目前還沒有在皮瓣中應(yīng)用的報道。我們選用Axitinib作為皮瓣外科延遲過程中內(nèi)源性VEGF的抑制劑,通過Axitinib抑制VEGF的表達(dá)來探討內(nèi)源性VEGF在皮瓣外科延遲中的生物學(xué)作用。本研究將從以下三個部分進行闡述。第一部分:大鼠多血管體穿支皮瓣模型的構(gòu)建本部分研究中,我們首先在體外觀察大鼠皮瓣模型構(gòu)建完成后大鼠的生活習(xí)性及皮瓣狀況,這是本研究的基礎(chǔ)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)外科延遲6天組,大鼠皮瓣顏色正常,質(zhì)地軟,毛細(xì)血管反應(yīng)實驗好,而對照組及延遲3天組大鼠皮瓣均有不同程度的壞死。進一步我們通過使用紅外熱成像儀成像觀察皮瓣外科延遲后相鄰兩個血管間微小血管的吻合(choke vessels)區(qū)的血管變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)外科延遲6天組,大鼠的胸背動脈和肋間后動脈(the thoracodorsal artery and posterior intercostal artery,TD-PIC)choke vessels區(qū)與肋間后動脈和旋骼深動脈(posterior intercostal artery and the deep circumflex iliac artery,PIC-DCI)choke vessels區(qū)的白色熱點均有明顯增加,表明外科延遲可將choke vessels區(qū)的血管轉(zhuǎn)化為直接連接。為證實外科延遲能有效改善皮瓣的存活能力,我們在預(yù)實驗中觀察外科延遲后皮瓣的存活面積,結(jié)果發(fā)現(xiàn),對照組皮瓣壞死面積較大而外科延遲6天組皮瓣的存活面積顯著高于對照組。綜上,本研究結(jié)果顯示,外科延遲能通過改變choke vessels區(qū)的血管狀況進而改善皮瓣的存活能力,另外,在本實驗中使用的皮瓣模型最佳延遲時間可能是6天。由于皮瓣choke vessels區(qū)血管的變化可能與內(nèi)源性VEGF的生成有關(guān),因此在本研究的第二部分我們將對外科延遲過程中產(chǎn)生的內(nèi)源性VEGF進行抑制,并對抑制的有效性以及抑制率進行研究分析。第二部分:Axitinib在皮瓣外科延遲中對VEGF抑制有效性的研究在本部分研究中,我們首先對Axitinib抑制VEGF的最佳劑量進行了測定。研究發(fā)現(xiàn)Axitinib注射劑量為10mg/kg,2次/天時,可以達(dá)到最佳的抑制效果。我們進一步通過western blot分別檢測外科延遲后以及Axitinib抑制外科延遲后皮瓣choke vessels區(qū)的VEGF及其信號分子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示外科延遲3天,VEGF的表達(dá)量最大;而Axitinib抑制后,VEGF的表達(dá)量顯著下降。我們進一步研究了磷酸化的血管內(nèi)皮生長因子受體(phosphorylated-vascular endothelial growth factor receptor,p-VEGFR)的表達(dá)情況,結(jié)果顯示外科延遲3天,p-VEGFR的表達(dá)量最大;而Axitinib抑制后,皮瓣中的p-VEGFR的表達(dá)也顯著下降。上述結(jié)果表明Axitinib能通過抑制p-VEGFR的表達(dá)進而抑制內(nèi)源性VEGF的產(chǎn)生。為進一步證實我們抑制的有效性,我們對VEGF細(xì)胞內(nèi)的下游信號通路進行分析。Western blot結(jié)果顯示皮瓣外科延遲能激活VEGF介導(dǎo)的Akt-mTOR-HIF-1α信號通路、PI3K-Akt的細(xì)胞增殖通路以及eNOS/Akt信號通路,而經(jīng)Axitinib抑制后這些信號通路則被明顯抑制。進一步我們使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測Axitinib抑制內(nèi)源性VEGF的抑制率,結(jié)果顯示,抑制第6天,抑制率高達(dá)91.6%。綜上,本部分的研究結(jié)果顯示,Axitinib抑制VEGF的最佳劑量是10mg/kg。外科延遲能有效增加皮瓣中內(nèi)源性VEGF的表達(dá)并活化其下游信號傳導(dǎo)通路。而Axitinib能通過抑制VEGFR的磷酸化進而抑制內(nèi)源性VEGF的產(chǎn)生,并且由VEGF介導(dǎo)的Akt-mTOR-HIF-1α信號通路、PI3K-Akt的細(xì)胞增殖、凋亡通路以及eNOS/Akt信號通路也被有效抑制了。VEGF的抑制率91.6%表明Axitinib抑制的有效性。在下一部分研究中我們將觀察并探討Axitinib抑制外科延遲中產(chǎn)生的內(nèi)源性VEGF后,皮瓣choke vessels區(qū)的血管在分子水平的變化,進而證實內(nèi)源性VEGF在皮瓣外科延遲中的作用。第三部分:內(nèi)源性VEGF在皮瓣外科延遲中作用的研究在前兩部分研究中,我們觀察并探討了本實驗大鼠皮瓣模型的最佳延遲時間以及Axitinib抑制VEGF的最佳抑制時間以及抑制的有效性。在本部分研究中,我們首先從分子水平探討內(nèi)源性VEGF在皮瓣外科延遲的作用。結(jié)果顯示:內(nèi)源性VEGF具有能改善皮瓣外科延遲中choke vessels區(qū)血管舒張的作用。雖然外科延遲3天時已經(jīng)出現(xiàn)choke vessels區(qū)的血管舒張,但在外科延遲6天時該效應(yīng)達(dá)到最大。我們使用anti-CD31抗體檢測choke vessels區(qū)的微血管密度,結(jié)果顯示內(nèi)源性VEGF也具有能改善皮瓣外科延遲中choke vessels區(qū)微血管生成的作用。但這種作用在外科延遲3天時不明顯,在外科延遲6天時效應(yīng)達(dá)到最大。進一步我們將延遲組及抑制組的皮瓣存活面積進行比較發(fā)現(xiàn):外科延遲6天組的皮瓣存活面積顯著高于抑制6天組,外科延遲6天時,皮瓣的存活面積高達(dá)94.6%;另外,抑制組6天組的皮瓣存活面積顯著低于對照組。這表明內(nèi)源性VEGF能有效改善外科延遲后皮瓣的存活能力。綜上,本部分研究顯示在皮瓣外科延遲過程中,內(nèi)源性的VEGF既具有促進choke vessels區(qū)血管舒張的作用也具有促進choke vessels區(qū)血管生成的作用,并且能有效改善皮瓣的存活能力。
【圖文】：

6圖 2.1 VEGF 亞型結(jié)構(gòu)示意圖[49]Fig 2.1 Schematic diagram of VEGF subtypesVEGF 需要與相應(yīng)的受體結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)活性。目前已知的血管內(nèi)皮生長因子受體有 VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3 及兩個輔助受體神經(jīng)氈蛋白Neuropilin-1(Nrp1)和 Neuropilin-2(Nrp2)[45, 50, 51]。所有受體均為酪氨酸激酶受體超家族膜蛋白，其特征為均有胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。不同的 VEGF 亞型能選擇性的與特異性的受體結(jié)合，VEGF-A能與VEGFR-1和 VEGFR-2結(jié)合，VEGF-B和 PIGF 只能與 VEGFR-1 結(jié)合，，VEGF-C 和 VEGF-D 均能與 VEGFR-2 和VEGFR-3 結(jié)合，而 VEGF-E 只能與 VEGFR-2 結(jié)合[52]。不同的 VEGFR 受體分布

第 2 章 綜 述位置也不同。VEGFR-1 和 VEGFR-2 主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，與內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、血管生成以及毛細(xì)血管的通透性有密切關(guān)系[53-55]。另外，VEGFR-1 在滋養(yǎng)層細(xì)胞、單核細(xì)胞以及腎小球系膜細(xì)胞中也有表達(dá)，VEGFR-2 也存在于造血干血胞、巨核細(xì)胞以及視網(wǎng)膜祖細(xì)胞中，而 VEGFR-3 主要存在于靜脈和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中，其作用主要是調(diào)控生長發(fā)育及淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的生長，Nrp1 和 Nrp2主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)軸突中，其作用的發(fā)揮需要依賴于 VEGFR-2，單獨無明顯作用[50]。（圖 2.2）
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R622

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本文編號：2707317