【摘要】：穿支皮瓣移植是修復(fù)各種腫瘤(乳腺腫瘤、頭頸部腫瘤及黑色素瘤)切除后、外傷、各種慢性病(糖尿病足、褥瘡)以及先天畸形所造成的皮膚軟組織缺損最為常用的手術(shù)方法。盡管隨著顯微外科技術(shù)的發(fā)展以及解剖知識的完善,穿支皮瓣移植的壞死率已大大降低,但穿支皮瓣遠(yuǎn)端的部分壞死仍然是當(dāng)今整形外科面臨的一個(gè)重要難題。皮瓣壞死不僅給患者帶來了沉重的心理壓力,而且增加了住院時(shí)間以及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。當(dāng)前的研究表明不充足的血液供應(yīng)以及缺血再灌注損傷是穿支皮瓣壞死的主要因素,因此尋求解決這些問題的方法尤為重要。皮瓣的外科延遲是當(dāng)前研究時(shí)間最長,同時(shí)也是臨床上已經(jīng)被證實(shí)可以有效改善皮瓣存活率的一種方法。雖然其作用機(jī)制仍未完全明確,但許多細(xì)胞因子如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor beta,TGF-β)以及胎盤生長因子(Placeta Growth Factor,PIGF)均被證實(shí)能有效改善皮瓣的存活能力,其中,以VEGF的作用效果最為明顯。VEGF是一種強(qiáng)有力的促血管生成的細(xì)胞生長因子,在機(jī)體的正常生理和病理?xiàng)l件下均發(fā)揮著重要的作用,其效應(yīng)主要有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖以及血管發(fā)生、促進(jìn)炎癥以及增加血管通透性等。目前有關(guān)VEGF改善皮瓣存活能力的大部分研究都是通過將外源性的VEGF注射到皮瓣模型中進(jìn)行研究的,對于皮瓣外科延遲中產(chǎn)生的內(nèi)源性VEGF的作用目前仍不清楚。阿西替尼(Axitinib)是一種有效的、選擇性的抑制血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)酪氨酸激酶的二代抑制劑,能有效抑制內(nèi)源性VEGF的產(chǎn)生。目前其抑制各種實(shí)質(zhì)性腫瘤的作用已經(jīng)被證實(shí),但目前還沒有在皮瓣中應(yīng)用的報(bào)道。我們選用Axitinib作為皮瓣外科延遲過程中內(nèi)源性VEGF的抑制劑,通過Axitinib抑制VEGF的表達(dá)來探討內(nèi)源性VEGF在皮瓣外科延遲中的生物學(xué)作用。本研究將從以下三個(gè)部分進(jìn)行闡述。第一部分:大鼠多血管體穿支皮瓣模型的構(gòu)建本部分研究中,我們首先在體外觀察大鼠皮瓣模型構(gòu)建完成后大鼠的生活習(xí)性及皮瓣?duì)顩r,這是本研究的基礎(chǔ)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)外科延遲6天組,大鼠皮瓣顏色正常,質(zhì)地軟,毛細(xì)血管反應(yīng)實(shí)驗(yàn)好,而對照組及延遲3天組大鼠皮瓣均有不同程度的壞死。進(jìn)一步我們通過使用紅外熱成像儀成像觀察皮瓣外科延遲后相鄰兩個(gè)血管間微小血管的吻合(choke vessels)區(qū)的血管變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)外科延遲6天組,大鼠的胸背動(dòng)脈和肋間后動(dòng)脈(the thoracodorsal artery and posterior intercostal artery,TD-PIC)choke vessels區(qū)與肋間后動(dòng)脈和旋骼深動(dòng)脈(posterior intercostal artery and the deep circumflex iliac artery,PIC-DCI)choke vessels區(qū)的白色熱點(diǎn)均有明顯增加,表明外科延遲可將choke vessels區(qū)的血管轉(zhuǎn)化為直接連接。為證實(shí)外科延遲能有效改善皮瓣的存活能力,我們在預(yù)實(shí)驗(yàn)中觀察外科延遲后皮瓣的存活面積,結(jié)果發(fā)現(xiàn),對照組皮瓣壞死面積較大而外科延遲6天組皮瓣的存活面積顯著高于對照組。綜上,本研究結(jié)果顯示,外科延遲能通過改變choke vessels區(qū)的血管狀況進(jìn)而改善皮瓣的存活能力,另外,在本實(shí)驗(yàn)中使用的皮瓣模型最佳延遲時(shí)間可能是6天。由于皮瓣choke vessels區(qū)血管的變化可能與內(nèi)源性VEGF的生成有關(guān),因此在本研究的第二部分我們將對外科延遲過程中產(chǎn)生的內(nèi)源性VEGF進(jìn)行抑制,并對抑制的有效性以及抑制率進(jìn)行研究分析。第二部分:Axitinib在皮瓣外科延遲中對VEGF抑制有效性的研究在本部分研究中,我們首先對Axitinib抑制VEGF的最佳劑量進(jìn)行了測定。研究發(fā)現(xiàn)Axitinib注射劑量為10mg/kg,2次/天時(shí),可以達(dá)到最佳的抑制效果。我們進(jìn)一步通過western blot分別檢測外科延遲后以及Axitinib抑制外科延遲后皮瓣choke vessels區(qū)的VEGF及其信號分子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示外科延遲3天,VEGF的表達(dá)量最大;而Axitinib抑制后,VEGF的表達(dá)量顯著下降。我們進(jìn)一步研究了磷酸化的血管內(nèi)皮生長因子受體(phosphorylated-vascular endothelial growth factor receptor,p-VEGFR)的表達(dá)情況,結(jié)果顯示外科延遲3天,p-VEGFR的表達(dá)量最大;而Axitinib抑制后,皮瓣中的p-VEGFR的表達(dá)也顯著下降。上述結(jié)果表明Axitinib能通過抑制p-VEGFR的表達(dá)進(jìn)而抑制內(nèi)源性VEGF的產(chǎn)生。為進(jìn)一步證實(shí)我們抑制的有效性,我們對VEGF細(xì)胞內(nèi)的下游信號通路進(jìn)行分析。Western blot結(jié)果顯示皮瓣外科延遲能激活VEGF介導(dǎo)的Akt-mTOR-HIF-1α信號通路、PI3K-Akt的細(xì)胞增殖通路以及eNOS/Akt信號通路,而經(jīng)Axitinib抑制后這些信號通路則被明顯抑制。進(jìn)一步我們使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測Axitinib抑制內(nèi)源性VEGF的抑制率,結(jié)果顯示,抑制第6天,抑制率高達(dá)91.6%。綜上,本部分的研究結(jié)果顯示,Axitinib抑制VEGF的最佳劑量是10mg/kg。外科延遲能有效增加皮瓣中內(nèi)源性VEGF的表達(dá)并活化其下游信號傳導(dǎo)通路。而Axitinib能通過抑制VEGFR的磷酸化進(jìn)而抑制內(nèi)源性VEGF的產(chǎn)生,并且由VEGF介導(dǎo)的Akt-mTOR-HIF-1α信號通路、PI3K-Akt的細(xì)胞增殖、凋亡通路以及eNOS/Akt信號通路也被有效抑制了。VEGF的抑制率91.6%表明Axitinib抑制的有效性。在下一部分研究中我們將觀察并探討Axitinib抑制外科延遲中產(chǎn)生的內(nèi)源性VEGF后,皮瓣choke vessels區(qū)的血管在分子水平的變化,進(jìn)而證實(shí)內(nèi)源性VEGF在皮瓣外科延遲中的作用。第三部分:內(nèi)源性VEGF在皮瓣外科延遲中作用的研究在前兩部分研究中,我們觀察并探討了本實(shí)驗(yàn)大鼠皮瓣模型的最佳延遲時(shí)間以及Axitinib抑制VEGF的最佳抑制時(shí)間以及抑制的有效性。在本部分研究中,我們首先從分子水平探討內(nèi)源性VEGF在皮瓣外科延遲的作用。結(jié)果顯示:內(nèi)源性VEGF具有能改善皮瓣外科延遲中choke vessels區(qū)血管舒張的作用。雖然外科延遲3天時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)choke vessels區(qū)的血管舒張,但在外科延遲6天時(shí)該效應(yīng)達(dá)到最大。我們使用anti-CD31抗體檢測choke vessels區(qū)的微血管密度,結(jié)果顯示內(nèi)源性VEGF也具有能改善皮瓣外科延遲中choke vessels區(qū)微血管生成的作用。但這種作用在外科延遲3天時(shí)不明顯,在外科延遲6天時(shí)效應(yīng)達(dá)到最大。進(jìn)一步我們將延遲組及抑制組的皮瓣存活面積進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn):外科延遲6天組的皮瓣存活面積顯著高于抑制6天組,外科延遲6天時(shí),皮瓣的存活面積高達(dá)94.6%;另外,抑制組6天組的皮瓣存活面積顯著低于對照組。這表明內(nèi)源性VEGF能有效改善外科延遲后皮瓣的存活能力。綜上,本部分研究顯示在皮瓣外科延遲過程中,內(nèi)源性的VEGF既具有促進(jìn)choke vessels區(qū)血管舒張的作用也具有促進(jìn)choke vessels區(qū)血管生成的作用,并且能有效改善皮瓣的存活能力。
【圖文】：
6圖 2.1 VEGF 亞型結(jié)構(gòu)示意圖[49]Fig 2.1 Schematic diagram of VEGF subtypesVEGF 需要與相應(yīng)的受體結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)活性。目前已知的血管內(nèi)皮生長因子受體有 VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3 及兩個(gè)輔助受體神經(jīng)氈蛋白Neuropilin-1(Nrp1)和 Neuropilin-2(Nrp2)[45, 50, 51]。所有受體均為酪氨酸激酶受體超家族膜蛋白，其特征為均有胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。不同的 VEGF 亞型能選擇性的與特異性的受體結(jié)合，VEGF-A能與VEGFR-1和 VEGFR-2結(jié)合，VEGF-B和 PIGF 只能與 VEGFR-1 結(jié)合，，VEGF-C 和 VEGF-D 均能與 VEGFR-2 和VEGFR-3 結(jié)合，而 VEGF-E 只能與 VEGFR-2 結(jié)合[52]。不同的 VEGFR 受體分布
第 2 章 綜 述位置也不同。VEGFR-1 和 VEGFR-2 主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，與內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、血管生成以及毛細(xì)血管的通透性有密切關(guān)系[53-55]。另外，VEGFR-1 在滋養(yǎng)層細(xì)胞、單核細(xì)胞以及腎小球系膜細(xì)胞中也有表達(dá)，VEGFR-2 也存在于造血干血胞、巨核細(xì)胞以及視網(wǎng)膜祖細(xì)胞中，而 VEGFR-3 主要存在于靜脈和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中，其作用主要是調(diào)控生長發(fā)育及淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的生長，Nrp1 和 Nrp2主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)軸突中，其作用的發(fā)揮需要依賴于 VEGFR-2，單獨(dú)無明顯作用[50]。（圖 2.2）
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R622
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本文編號：
2707317
