【摘要】：在過去的三十年中,糖尿病在全世界范圍內(nèi)已成為一種新型“流行病”,目前我國的糖尿病患者已超過1億,居全球第一位。對于糖尿病患者而言,任何創(chuàng)面均有可能發(fā)展形成嚴重感染的慢性創(chuàng)面,甚至造成截肢,嚴重影響愈合及患者生存質(zhì)量。在控制血糖的前提下,對于創(chuàng)面徹底清創(chuàng)、避免感染,促進創(chuàng)面愈合是糖尿病創(chuàng)面主要的治療方式。但是傳統(tǒng)方法存在治療時間長、次數(shù)多、復發(fā)率高的問題,臨床對于新型有效的治療方法需求極大。羊膜位于胎盤最內(nèi)層,厚度約為8-12um,不含神經(jīng)及血管。研究表明羊膜具有促進細胞遷移及擴增、免疫源性低、減輕炎癥、含有大量的生長因子和細胞因子等特點。自1910年羊膜首次作為敷料用以創(chuàng)面治療以來,隨著保存技術(shù)的發(fā)展,使羊膜在眼科疾病、燒傷救治、整形修復、口腔疾病及神經(jīng)外科等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。羊膜上皮層是由單層立方上皮細胞構(gòu)成,稱之為羊膜上皮細胞。多項研究表明,人羊膜上皮細胞表達多種干細胞標志物,并具有向三個胚層分化的能力,而且能夠分泌多種生長因子。同時因其來源廣泛和便于分離,無免疫源性和致瘤性,使羊膜上皮細胞成為移植和再生醫(yī)學潛在的細胞來源。羊膜上皮細胞在組織修復中的應(yīng)用已有諸多報道,目前羊膜上皮細胞已在肝、神經(jīng)、肺、心肌甚至腫瘤治療中都有一定的優(yōu)勢,但是尚少有羊膜上皮細胞應(yīng)用于糖尿病創(chuàng)面的研究。因此在本課題中,我們通過提取培養(yǎng)羊膜上皮細胞,應(yīng)用于糖尿病創(chuàng)面中以觀察其對于創(chuàng)面愈合的作用并對其機制進行初步探索。第一部分人羊膜上皮細胞體外分離培養(yǎng)鑒定及生物學特性檢測目的:分離培養(yǎng)人原代羊膜上皮細胞并檢測鑒定。方法:收集剖宮產(chǎn)胎盤分離羊膜,通過酶消化法提取羊膜上皮細胞體外培養(yǎng)。流式細胞計數(shù)檢測羊膜上皮細胞表型,免疫熒光法及RT-PCR法檢測羊膜上皮細胞干性標志物,最后對其進行三胚層誘導檢測其分化潛能。結(jié)果:體外人羊膜上皮細胞鏡下觀察可見細胞成鵝卵石樣成團生長,核圓,居中,細胞呈多邊形,邊界清楚,輪廓分明。通過流式細胞儀檢測顯示培養(yǎng)細胞表達CD29、CD44、CD73、CD90、CD105,但是不表達CD45、CD34。通過免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),羊膜上皮細胞表達SSEA-3、SSEA-4、OCT4。RT-PCR結(jié)果顯示羊膜上皮細胞表達OCT-4、Sox-2、NANOG等干性基因。誘導分化實驗證明羊膜上皮細胞具有向三胚層分化潛能。結(jié)論:采用酶消化法成功分離培養(yǎng)羊膜上皮細胞,其可以表達多種干細胞標志物,并能夠向三胚層分化,在組織修復中具有很大的潛力。第二部分羊膜上皮細胞促進糖尿病創(chuàng)面愈合作用的研究目的:研究羊膜上皮細胞對于糖尿病創(chuàng)面愈合的作用。方法:將原代提取的羊膜上皮細胞局部注射糖尿病創(chuàng)面,觀察創(chuàng)面愈合情況。收集創(chuàng)面標本行病理學以觀察創(chuàng)面愈合情況;行CD31免疫組化檢測創(chuàng)面血管化;行CD68、iNOS、CD206免疫熒光檢測巨噬細胞極化;行促炎因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)和促進愈合因子(VEGF、TGF-β1、IGF-1)的ELISA檢測炎癥反應(yīng)的改變。通過標記羊膜上皮細胞,觀察羊膜上皮細胞在創(chuàng)面的轉(zhuǎn)歸情況。結(jié)果:(1)與空白組相比,羊膜上皮細胞組在創(chuàng)面第10、14天創(chuàng)面愈合率明顯升高(P0.01)。(2)通過病理檢測顯示創(chuàng)面第10天羊膜上皮細胞組新生肉芽組織厚度較PBS組明顯增加(P0.01);CD31免疫組化顯示創(chuàng)面羊膜上皮細胞組創(chuàng)面新生毛細血管密度較PBS組明顯增多(P0.01);羊膜上皮細胞組創(chuàng)面M1型巨噬細胞密度明顯低于PBS組(P0.01),M2型巨噬細胞密度明顯增對高(P0.05),M1/M2比例也明顯降低(P0.01);羊膜上皮細胞組創(chuàng)面組織中VEGF、TGF-β1、IGF-1的表達量明顯高于PBS組的表達量(P0.01),而IL-1β、IL-6、TNF-α表達量明顯較空白組低(P0.01)。(3)羊膜上皮細胞植入創(chuàng)面第5天,可觀察到創(chuàng)面有大量羊膜上皮細胞存活;在創(chuàng)面第10天,可觀察到創(chuàng)面少量羊膜上皮細胞存活。結(jié)論:羊膜上皮細胞通過調(diào)控巨噬細胞極化、減輕創(chuàng)面炎癥反應(yīng)、促進創(chuàng)面血管新生以促進糖尿病創(chuàng)面愈合;同時其在創(chuàng)面存留時間較短,旁分泌作用可能在促進糖尿病創(chuàng)面愈合過程中起主要作用。第三部分羊膜上皮細胞促進糖尿病創(chuàng)面愈合機制的初步探討目的:探索羊膜上皮細胞對于糖尿病創(chuàng)面愈合作用的機制方法:(1)體外分離培養(yǎng)巨噬細胞,通過IFN-γ、TNF-α刺激模擬創(chuàng)面M0型巨噬細胞向M1型巨噬細胞轉(zhuǎn)化情況,觀察羊膜上皮細胞條件培養(yǎng)基對于巨噬細胞極化的作用,同時收集細胞行RT-PCR檢測其基因表達,實驗分組為:含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基+IFN-γTNF-α陽性對照組,含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基+羊膜上皮細胞條件培養(yǎng)基+IFN-γTNF-α組,含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基空白對照組。(2)體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞,通過CCK-8試劑盒、Transwell小室以及成管試驗來觀察羊膜上皮細胞條件培養(yǎng)對于人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖、遷移及成管能力的影響,實驗設(shè)計分為3組:含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基陽性對照組,羊膜上皮細胞條件培養(yǎng)基組,高糖DMEM陰性對照組。結(jié)果:(1)應(yīng)用羊膜上皮細胞條件培養(yǎng)基對于TNF-α和IFN-γ刺激的巨噬細胞可以減少細胞周圍的細短樹突狀突起;羊膜上皮細胞條件培養(yǎng)基處理組巨噬細胞CD206(M2型巨噬細胞標志物)的表達量較空白對照組(P0.01)和陽性對照組明顯升高(P0.01);而iNOS(M1型巨噬細胞標志物)的表達量較空白組(P0.05)和陽性對照組明顯降低(P0.01)。(2)CCK-8試劑盒檢測人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖活性顯示,應(yīng)用羊膜上皮細胞條件培養(yǎng)基處理組較陰性對照組能夠明顯促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖(P0.01);Transwell小室檢測遷移能力結(jié)果表明羊膜上皮細胞條件培養(yǎng)基處理組細胞個數(shù)較陰性對照組明顯增多(P0.01);通過成管實驗檢測細胞成管能力,結(jié)果顯示羊膜上皮細胞條件培養(yǎng)基處理組成管個數(shù)較陰性對照組明顯增多(P0.01)。結(jié)論:羊膜上皮細胞可以明顯提高人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖、遷移及成管能力,還可以逆轉(zhuǎn)巨噬細胞向M1型轉(zhuǎn)化,同時可以促進M1型巨噬細胞向M2型細胞轉(zhuǎn)化,并以此促進糖尿病創(chuàng)面的愈合。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2;R641

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 鄭仕清;陳甜勝;紀世召;羅鵬飛;肖仕初;;羊膜移植物的制備及臨床應(yīng)用研究進展[J];中華燒傷雜志;2017年08期

2 朱琳楠;侯玉柱;趙勇;;精氨酸酶Ⅰ及誘生性一氧化氮合酶在巨噬細胞中的分子表達調(diào)控[J];中國免疫學雜志;2010年08期

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本文編號：2702301