發(fā)布時間：2020-06-08 12:09

【摘要】：研究背景:骨肉瘤(OS)是世界各地兒童和青少年有關(guān)癌癥死亡的主要原因之一。骨肉瘤的診斷和臨床治療取得了顯著的進步,五年的總體生存率已提高到了70%以上。然而,對于那些患有晚期,惡性和/或復(fù)發(fā)性骨肉瘤的患者,預(yù)后仍然很差。因此,本研究組一直致力于了解骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的病理機制,并開發(fā)新型抗骨肉瘤藥物。微小RNA(micro RNA)屬于一組小編碼調(diào)控RNA分子,其在OS中的作用越來越得到重視。研究目標(biāo):明確micro RNA-135b(miR-135b)抑制人骨肉瘤細胞的增殖作用及其分子機制,為發(fā)現(xiàn)一種新穎、有效的靶向療法來治療這種異質(zhì)復(fù)雜的疾病提供分子生物學(xué)的依據(jù)。研究方法和內(nèi)容:1.運用實時定量PCR(qRT-PCR),蛋白質(zhì)免疫印跡實驗(Western blotting)等方法研究人骨肉瘤組織及MG-63,U2OS人骨肉瘤細胞中miR-135b-5p、Ppm1e RNA的表達水平和Ppm1e、p-AMPKα1蛋白的的表達水平;2.轉(zhuǎn)染慢病毒包裹miR-135b-5p表達載體,在MG-63,U2OS人骨肉瘤細胞中過表達miR-135b-5p,運用PCR,蛋白質(zhì)免疫印跡觀察轉(zhuǎn)染細胞的Ppm1e RNA及蛋白和p-AMPKα1蛋白的表達水平變化;3.轉(zhuǎn)染慢病毒包裹miR-135b-5p表達載體,在MG-63,U2OS人骨肉瘤細胞中過表達miR-135b-5p,運用細胞計數(shù)試劑盒,細胞集落實驗,Brd U ELISA觀察轉(zhuǎn)染細胞增殖變化;4.轉(zhuǎn)染慢病毒包裹Ppm1e shRNA敲減Ppm1e后,在MG-63人骨肉瘤細胞中,運用細胞計數(shù)試劑盒,細胞集落實驗,Brd U ELISA檢測觀察細胞增殖的變化;5.通過轉(zhuǎn)染慢病毒包裹的AMPKα1 shRNA或AMPKα1顯性負性遺傳突變(T172A)阻斷AMPK活化,在MG-63人骨肉瘤細胞中觀察它們對miR-135b-5p誘導(dǎo)的抗骨肉瘤細胞活性變化;6.將過表達Ppm1e shRNA、Vec-miR-135b的穩(wěn)轉(zhuǎn)U2OS人骨肉瘤細胞和對照的U2OS細胞建立裸鼠荷瘤模型,觀察上述腫瘤的生長情況,并運用實時定量PCR,蛋白質(zhì)免疫印跡和免疫組化檢測miR-135b-5p Ppm1e RNA和Ppm1e p-AMPKα1蛋白的表達水平變化。研究結(jié)果:1.與周圍正常骨組織相比,miR-135b-5p和p-AMPKα1在人骨肉瘤組織中呈低表達,而Ppm1e m RNA和蛋白高表達;2.在MG-63,U2OS人骨肉瘤細胞中轉(zhuǎn)染慢病毒包裹的miR-135b-5p,miR-135b-5p表達顯著上調(diào),并且顯著抑制Ppm1e表達并誘導(dǎo)AMPK磷酸化水平顯著上升;3.在MG-63,U2OS人骨肉瘤細胞中過表達miR-135b-5p顯著抑制骨肉瘤細胞的增殖;4.在MG-63人骨肉瘤細胞中shRNA方法敲減Ppm1e后,p-AMPKα1水平增加,腫瘤細胞增殖受到抑制;5.在MG-63人骨肉瘤細胞中,利用AMPKα1 shRNA或AMPKα1顯性負性遺傳突變(T172A)阻斷AMPK后幾乎逆轉(zhuǎn)了miR-135b-5p誘導(dǎo)的AMPK的活化的抗骨肉瘤細胞的活性的作用;6.將過表達Ppm1e shRNA、Vec-miR-135b的穩(wěn)轉(zhuǎn)U2OS人骨肉瘤細胞和對照的U2OS細胞建立裸鼠荷瘤模型相比,表達Ppm1e shRNA、Vec-miR-135b的腫瘤生長顯著受到抑制,Ppm1e RNA和蛋白顯著下調(diào),p-AMPKα1蛋白的表達水平顯著上調(diào)。研究結(jié)論:miR-135b-5p激活Ppm1e-AMPK信號通路抑制人骨肉瘤細胞增殖;
【圖文】：

人骨肉瘤組織中低表達 AMPK 去磷酸化酶 Ppm1e 而達到激活新的研究表明，miR-135b-5p 是特 miR-135b-5p 的靶基因[13,14]。因此，表達水平。如圖 1 所示，與周圍正常骨 miR-135b-5p 表達水平顯著下調(diào)（“腫水平僅為周圍正常組織的 30％左右（織中低表達。圖 1

在人骨肉瘤組織中高表達。與周圍or”）組織內(nèi) Ppm1e mRNA 的表達10）。P<0.01 (和正常骨組織比較)。肉瘤組織中高表達肉瘤組織中 miR-135b-5p 低表達我們運用 Western blotting（WB）示，和 mRNA 表達情況類似，，Ppm 10 組病人標(biāo)本的結(jié)果顯示，OS 組3）。圖 3
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R738.1

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本文編號：2703064