【摘要】：目的:主動脈夾層(Aortic dissection,AD)是一種心血管急危重癥,具有起病急、死亡率高、并發(fā)癥多的特點,嚴重威脅人類健康。主動脈中膜血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscles cells,VSMCs)的異常減少是主動脈夾層形成的主要病理基礎(chǔ)之一。因此,闡明VSMCs異常減少的發(fā)生機制將有助于降低AD的發(fā)生率和死亡率以及改善預后。最新研究發(fā)現(xiàn),VSMCs自噬增強與VSMCs數(shù)量減少密切相關(guān),該過程可能在AD的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。細胞自噬是受多種機制調(diào)控的一種生物學過程,有證據(jù)顯示蛋白質(zhì)的甲基化修飾與細胞自噬密切相關(guān)。Zeste基因增強子同源物2(Enhancer of zeste homolog 2,EZH2)是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶,目前研究證實其能調(diào)節(jié)組蛋白H3第27位賴氨酸二甲基化、三甲基化(H3K27me2,H3K27me3)狀態(tài)介導基因沉默,參與調(diào)控細胞增殖、遷移、凋亡等過程,但是EZH2是否能調(diào)控VSMCs自噬及其與AD發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚無相關(guān)研究報道。本課題旨在研究EZH2在主動脈夾層疾病中的作用及具體機制。方法:1.組織標本的收集、處理:主動脈夾層樣本取自16例Stanford A型主動脈夾層(Type A aortic dissection,TAAD)病人的主動脈壁,正常對照組樣本取自無主動脈疾病的心臟移植病人的主動脈壁。主動脈壁樣本經(jīng)石蠟包埋、切片后進行蘇木精-伊紅染色(HE染色)、彈性纖維染色(EVG染色),顯微鏡下觀察組織標本組織學變化。通過蛋白免疫印跡(Western blot)檢測組織標本中自噬標志分子LC3I/II蛋白表達水平,熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-Time PCR)實驗檢測EZH2的mRNA的表達水平。2.構(gòu)建EZH2功能缺失或功能增強的主動脈血管平滑肌細胞(MOVAS細胞)。EZH2功能缺失的MOVAS細胞:采用5μM特異性EZH2抑制劑UNC1999處理MOVAS細胞或用慢病毒包裝攜帶EZH2短發(fā)夾RNA(sh EZH2)的p Sico R質(zhì)粒感染MOVAS細胞,抑制或敲低EZH2。EZH2功能增強的MOVAS細胞:用慢病毒包裝攜帶目的基因EZH2的p Sico R質(zhì)粒感染MOVAS細胞,在MOVAS細胞中過表達EZH2。顯微鏡下觀察細胞,并在不同時間點(處理前、處理后6小時、12小時、24小時、36小時、48小時)分別進行細胞計數(shù),探明EZH2功能缺失或功能增強對主動脈平滑肌細胞的影響。3.檢測EZH2功能缺失或功能增強的MOVAS細胞的增殖、凋亡及自噬水平的變化,分析MOVAS細胞減少的原因:A.細胞增殖的檢測:采用Western blot實驗和免疫熒光實驗對細胞增殖標志分子PCNA和Ki67的表達進行檢測,PI染色流式細胞計數(shù)檢測細胞周期,觀察EZH2對細胞增殖的影響;B.凋亡的檢測:利用Annexin V-PE/7-AAD標記凋亡細胞,采用流式細胞技術(shù)進行細胞分選,記錄對照組、UNC1999抑制組、敲低EZH2組和過表達EZH2組凋亡細胞比例;C.自噬的檢測:電鏡下觀察EZH2功能缺失或增強的MOVAS細胞內(nèi)自噬體和自噬溶酶體形成的情況;采用Western blot實驗檢測自噬標志分子LC3I/II表達水平。4.檢測EZH2影響自噬及細胞存活的具體方式:A.采用Western blot實驗檢測自噬體形成調(diào)節(jié)分子ATG5和ATG7的蛋白表達水平;B.慢病毒包裹m Cherry-GFP-LC3質(zhì)粒感染MOVAS細胞,雙熒光標記LC3,倒置熒光顯微鏡下觀察并計數(shù),監(jiān)測自噬流的變化;C.用CQ或CQ+Rapamycin分別處理EZH2功能缺失或增強的MOVAS細胞,檢測自噬水平的變化;D.用慢病毒包裝攜帶ATG5或ATG7短發(fā)夾RNA(sh ATG5或sh AT7)的p Sico R質(zhì)粒感染EZH2功能缺失或增強的MOVAS細胞,檢測自噬和細胞數(shù)量的變化。5.探索EZH2發(fā)揮自噬調(diào)控作用的具體信號通路:采用Western blot實驗檢測AMPKα、m TOR、Akt和MEK-ERK1/2信號通路內(nèi)關(guān)鍵分子的表達情況,分析EZH2對相關(guān)信號通路活化的影響;用50μM MEK1抑制劑PD98059處理EZH2功能缺失的MOVAS細胞,Western blot實驗檢測自噬標志分子LC3I/II的表達,并進行細胞計數(shù),驗證MEK-ERK1/2信號通路在EZH2調(diào)控細胞自噬過程中的作用。結(jié)果:1.與正常主動脈壁標本相比,Stanford A型主動脈夾層主動脈壁組織中LC3II蛋白表達增強,EZH2的m RNA表達明顯減少。2.抑制或敲低EZH2后MOVAS細胞數(shù)量顯著減少,細胞自噬水平明顯增強,而細胞增殖或細胞凋亡水平?jīng)]有變化;抑制或敲低EZH2的MOVAS細胞中調(diào)控自噬體形成的關(guān)鍵分子ATG5和ATG7表達升高,電鏡下觀察自噬體數(shù)量增多。相反,過表達EZH2的MOVAS細胞數(shù)量增加,細胞自噬水平明顯減弱,而細胞增殖或細胞凋亡水平?jīng)]有變化;過表達EZH2的MOVAS細胞中調(diào)控自噬體形成的關(guān)鍵分子ATG5和ATG7表達降低,電鏡下觀察自噬體數(shù)量減少。進一步的研究顯示,敲低ATG5或ATG7能逆轉(zhuǎn)抑制或敲低EZH2導致的自噬增強和細胞數(shù)量減少。以上結(jié)果說明,EZH2通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白ATG5和ATG7的表達抑制自噬小體的形成,減弱細胞自噬,減少VSMCs自噬性死亡(Autophagic cell death,ACD)的發(fā)生。3.不論抑制或敲低EZH2還是過表達EZH2,AMPKα、m TOR信號通路活化均未受到影響。抑制EZH2的MOVAS細胞中Akt蛋白磷酸化水平相應降低,但是過表達Akt并不能逆轉(zhuǎn)抑制EZH2導致的自噬增強和細胞減少。另一方面,抑制或敲低EZH2能夠增強MEK-ERK1/2信號通路的活化,而過表達EZH2則抑制MEK-ERK1/2信號通路的活化;抑制MEK-ERK1/2信號通路能夠逆轉(zhuǎn)抑制或敲低EZH2導致的細胞自噬增強和細胞數(shù)量減少。以上結(jié)果提示,MEK-ERK1/2信號通路介導了EZH2調(diào)控VSMCs自噬性死亡的過程。結(jié)論:EZH2通過抑制ATG5和ATG7的表達阻遏自噬小體的形成,從而降低主動脈平滑肌細胞自噬水平,減少細胞自噬性死亡,防止主動脈壁血管平滑肌細胞異常減少,同時,MEK-ERK1/2信號通路也參與了EZH2調(diào)控血管平滑肌細胞自噬的過程。因此,EZH2有望成為臨床預防、診斷以及治療主動脈夾層的新靶點,并為開發(fā)治療主動脈夾層藥物提供了理論依據(jù)。
【圖文】：

定量 PCR 檢測主動脈壁組織中 EZH2 的 mRNA 水平，心臟移植病人的主動脈壁組織；TAAD：Stanford A 型主制 EZH2 活性對 MOVAS 細胞的影響究 EZH2 表達變化是否參與了主動脈平滑肌細制劑 UNC1999 處理小鼠主動脈平滑肌細胞，，研藥物濃度（0μM、0.01μM、0.1μM、0.5μM、1μ MOVAS 細胞 48 小時后提取細胞蛋白，通過 W1999 處理 MOVAS 細胞后細胞中 H3K27me2 和99 抑制 EZH2 的最佳濃度（圖 1-3A）。結(jié)果顯示27me2 和 H3K27me3 水平降低最為顯著。我們

圖 1-3 （A）經(jīng) UNC1999 濃度梯度給藥處理 MOVAS 細胞 48 小時后，Western blot 檢測H3K27me2、H3K27me3 的蛋白表達水平；（B）按 UNC1999 濃度梯度給藥處理 MOVAS 細胞48 小時后，乳酸脫氫酶檢測法檢測細胞損傷比例。*p<0.05 vs. DMSO。我們采用 5μM UNC1999 處理細胞后的不同時間點（0h、12h、24h、36h、48h）于
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R654.3

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本文編號：2701029