發(fā)布時(shí)間：2020-06-07 06:52

【摘要】：目的:主動(dòng)脈夾層(Aortic dissection,AD)是一種心血管急危重癥,具有起病急、死亡率高、并發(fā)癥多的特點(diǎn),嚴(yán)重威脅人類健康。主動(dòng)脈中膜血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscles cells,VSMCs)的異常減少是主動(dòng)脈夾層形成的主要病理基礎(chǔ)之一。因此,闡明VSMCs異常減少的發(fā)生機(jī)制將有助于降低AD的發(fā)生率和死亡率以及改善預(yù)后。最新研究發(fā)現(xiàn),VSMCs自噬增強(qiáng)與VSMCs數(shù)量減少密切相關(guān),該過程可能在AD的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞自噬是受多種機(jī)制調(diào)控的一種生物學(xué)過程,有證據(jù)顯示蛋白質(zhì)的甲基化修飾與細(xì)胞自噬密切相關(guān)。Zeste基因增強(qiáng)子同源物2(Enhancer of zeste homolog 2,EZH2)是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶,目前研究證實(shí)其能調(diào)節(jié)組蛋白H3第27位賴氨酸二甲基化、三甲基化(H3K27me2,H3K27me3)狀態(tài)介導(dǎo)基因沉默,參與調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等過程,但是EZH2是否能調(diào)控VSMCs自噬及其與AD發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚無相關(guān)研究報(bào)道。本課題旨在研究EZH2在主動(dòng)脈夾層疾病中的作用及具體機(jī)制。方法:1.組織標(biāo)本的收集、處理:主動(dòng)脈夾層樣本取自16例Stanford A型主動(dòng)脈夾層(Type A aortic dissection,TAAD)病人的主動(dòng)脈壁,正常對(duì)照組樣本取自無主動(dòng)脈疾病的心臟移植病人的主動(dòng)脈壁。主動(dòng)脈壁樣本經(jīng)石蠟包埋、切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(HE染色)、彈性纖維染色(EVG染色),顯微鏡下觀察組織標(biāo)本組織學(xué)變化。通過蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)組織標(biāo)本中自噬標(biāo)志分子LC3I/II蛋白表達(dá)水平,熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-Time PCR)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EZH2的mRNA的表達(dá)水平。2.構(gòu)建EZH2功能缺失或功能增強(qiáng)的主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(MOVAS細(xì)胞)。EZH2功能缺失的MOVAS細(xì)胞:采用5μM特異性EZH2抑制劑UNC1999處理MOVAS細(xì)胞或用慢病毒包裝攜帶EZH2短發(fā)夾RNA(sh EZH2)的p Sico R質(zhì)粒感染MOVAS細(xì)胞,抑制或敲低EZH2。EZH2功能增強(qiáng)的MOVAS細(xì)胞:用慢病毒包裝攜帶目的基因EZH2的p Sico R質(zhì)粒感染MOVAS細(xì)胞,在MOVAS細(xì)胞中過表達(dá)EZH2。顯微鏡下觀察細(xì)胞,并在不同時(shí)間點(diǎn)(處理前、處理后6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí))分別進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),探明EZH2功能缺失或功能增強(qiáng)對(duì)主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的影響。3.檢測(cè)EZH2功能缺失或功能增強(qiáng)的MOVAS細(xì)胞的增殖、凋亡及自噬水平的變化,分析MOVAS細(xì)胞減少的原因:A.細(xì)胞增殖的檢測(cè):采用Western blot實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞增殖標(biāo)志分子PCNA和Ki67的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),PI染色流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期,觀察EZH2對(duì)細(xì)胞增殖的影響;B.凋亡的檢測(cè):利用Annexin V-PE/7-AAD標(biāo)記凋亡細(xì)胞,采用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞分選,記錄對(duì)照組、UNC1999抑制組、敲低EZH2組和過表達(dá)EZH2組凋亡細(xì)胞比例;C.自噬的檢測(cè):電鏡下觀察EZH2功能缺失或增強(qiáng)的MOVAS細(xì)胞內(nèi)自噬體和自噬溶酶體形成的情況;采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自噬標(biāo)志分子LC3I/II表達(dá)水平。4.檢測(cè)EZH2影響自噬及細(xì)胞存活的具體方式:A.采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自噬體形成調(diào)節(jié)分子ATG5和ATG7的蛋白表達(dá)水平;B.慢病毒包裹m Cherry-GFP-LC3質(zhì)粒感染MOVAS細(xì)胞,雙熒光標(biāo)記LC3,倒置熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù),監(jiān)測(cè)自噬流的變化;C.用CQ或CQ+Rapamycin分別處理EZH2功能缺失或增強(qiáng)的MOVAS細(xì)胞,檢測(cè)自噬水平的變化;D.用慢病毒包裝攜帶ATG5或ATG7短發(fā)夾RNA(sh ATG5或sh AT7)的p Sico R質(zhì)粒感染EZH2功能缺失或增強(qiáng)的MOVAS細(xì)胞,檢測(cè)自噬和細(xì)胞數(shù)量的變化。5.探索EZH2發(fā)揮自噬調(diào)控作用的具體信號(hào)通路:采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AMPKα、m TOR、Akt和MEK-ERK1/2信號(hào)通路內(nèi)關(guān)鍵分子的表達(dá)情況,分析EZH2對(duì)相關(guān)信號(hào)通路活化的影響;用50μM MEK1抑制劑PD98059處理EZH2功能缺失的MOVAS細(xì)胞,Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自噬標(biāo)志分子LC3I/II的表達(dá),并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),驗(yàn)證MEK-ERK1/2信號(hào)通路在EZH2調(diào)控細(xì)胞自噬過程中的作用。結(jié)果:1.與正常主動(dòng)脈壁標(biāo)本相比,Stanford A型主動(dòng)脈夾層主動(dòng)脈壁組織中LC3II蛋白表達(dá)增強(qiáng),EZH2的m RNA表達(dá)明顯減少。2.抑制或敲低EZH2后MOVAS細(xì)胞數(shù)量顯著減少,細(xì)胞自噬水平明顯增強(qiáng),而細(xì)胞增殖或細(xì)胞凋亡水平?jīng)]有變化;抑制或敲低EZH2的MOVAS細(xì)胞中調(diào)控自噬體形成的關(guān)鍵分子ATG5和ATG7表達(dá)升高,電鏡下觀察自噬體數(shù)量增多。相反,過表達(dá)EZH2的MOVAS細(xì)胞數(shù)量增加,細(xì)胞自噬水平明顯減弱,而細(xì)胞增殖或細(xì)胞凋亡水平?jīng)]有變化;過表達(dá)EZH2的MOVAS細(xì)胞中調(diào)控自噬體形成的關(guān)鍵分子ATG5和ATG7表達(dá)降低,電鏡下觀察自噬體數(shù)量減少。進(jìn)一步的研究顯示,敲低ATG5或ATG7能逆轉(zhuǎn)抑制或敲低EZH2導(dǎo)致的自噬增強(qiáng)和細(xì)胞數(shù)量減少。以上結(jié)果說明,EZH2通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白ATG5和ATG7的表達(dá)抑制自噬小體的形成,減弱細(xì)胞自噬,減少VSMCs自噬性死亡(Autophagic cell death,ACD)的發(fā)生。3.不論抑制或敲低EZH2還是過表達(dá)EZH2,AMPKα、m TOR信號(hào)通路活化均未受到影響。抑制EZH2的MOVAS細(xì)胞中Akt蛋白磷酸化水平相應(yīng)降低,但是過表達(dá)Akt并不能逆轉(zhuǎn)抑制EZH2導(dǎo)致的自噬增強(qiáng)和細(xì)胞減少。另一方面,抑制或敲低EZH2能夠增強(qiáng)MEK-ERK1/2信號(hào)通路的活化,而過表達(dá)EZH2則抑制MEK-ERK1/2信號(hào)通路的活化;抑制MEK-ERK1/2信號(hào)通路能夠逆轉(zhuǎn)抑制或敲低EZH2導(dǎo)致的細(xì)胞自噬增強(qiáng)和細(xì)胞數(shù)量減少。以上結(jié)果提示,MEK-ERK1/2信號(hào)通路介導(dǎo)了EZH2調(diào)控VSMCs自噬性死亡的過程。結(jié)論:EZH2通過抑制ATG5和ATG7的表達(dá)阻遏自噬小體的形成,從而降低主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞自噬水平,減少細(xì)胞自噬性死亡,防止主動(dòng)脈壁血管平滑肌細(xì)胞異常減少,同時(shí),MEK-ERK1/2信號(hào)通路也參與了EZH2調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞自噬的過程。因此,EZH2有望成為臨床預(yù)防、診斷以及治療主動(dòng)脈夾層的新靶點(diǎn),并為開發(fā)治療主動(dòng)脈夾層藥物提供了理論依據(jù)。
【圖文】：

定量 PCR 檢測(cè)主動(dòng)脈壁組織中 EZH2 的 mRNA 水平，心臟移植病人的主動(dòng)脈壁組織；TAAD：Stanford A 型主制 EZH2 活性對(duì) MOVAS 細(xì)胞的影響究 EZH2 表達(dá)變化是否參與了主動(dòng)脈平滑肌細(xì)制劑 UNC1999 處理小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，，研藥物濃度（0μM、0.01μM、0.1μM、0.5μM、1μ MOVAS 細(xì)胞 48 小時(shí)后提取細(xì)胞蛋白，通過 W1999 處理 MOVAS 細(xì)胞后細(xì)胞中 H3K27me2 和99 抑制 EZH2 的最佳濃度（圖 1-3A）。結(jié)果顯示27me2 和 H3K27me3 水平降低最為顯著。我們

圖 1-3 （A）經(jīng) UNC1999 濃度梯度給藥處理 MOVAS 細(xì)胞 48 小時(shí)后，Western blot 檢測(cè)H3K27me2、H3K27me3 的蛋白表達(dá)水平；（B）按 UNC1999 濃度梯度給藥處理 MOVAS 細(xì)胞48 小時(shí)后，乳酸脫氫酶檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞損傷比例。*p<0.05 vs. DMSO。我們采用 5μM UNC1999 處理細(xì)胞后的不同時(shí)間點(diǎn)（0h、12h、24h、36h、48h）于
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R654.3

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本文編號(hào)：2701029