【摘要】：成骨不全(osteogenesis imperfecta,OI)是一種間充質(zhì)組織發(fā)育不全,膠原形成障礙而造成的罕見性先天遺傳病,遺傳方式為常染色體顯性或隱形遺傳。臨床癥狀表現(xiàn)為骨質(zhì)脆弱、藍(lán)鞏膜、牙本質(zhì)發(fā)育不全、聽力障礙等。目前共發(fā)現(xiàn)20個(gè)基因突變與OI發(fā)病相關(guān),90%以上患者病源于編碼Ⅰ型前膠原α鏈的COL1A1和COL1A2基因發(fā)生突變,導(dǎo)致膠原合成量下降或結(jié)構(gòu)改變,表現(xiàn)為顯性遺傳。其余10%左右的患者致病基因種類繁多,與Ⅰ型膠原蛋白代謝密切相關(guān),涉及到膠原翻譯后修飾過程、膠原折疊裝配及分泌過程異常、成骨細(xì)胞分化、鈣離子通道、WNT信號(hào)通路等骨發(fā)育的諸多方面。其中報(bào)道的WNT1基因突變導(dǎo)致的成骨不全患者較少,共計(jì)25人。WNT1基因突變?cè)诔晒遣蝗械闹虏》肿訖C(jī)制尚不明確,有待進(jìn)一步深入研究。目的:進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室前期成骨不全患者血液樣本進(jìn)行高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)的WNT1基因候選突變位點(diǎn),以發(fā)現(xiàn)成骨不全患者中WNT1基因的新的突變位點(diǎn)。過表達(dá)WNT1突變體,進(jìn)行TOPflash實(shí)驗(yàn)、WNT1蛋白顯性負(fù)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)和Saos2細(xì)胞礦化實(shí)驗(yàn)。同時(shí),構(gòu)建circRNA熒光素酶報(bào)告載體,進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn),檢測(cè)circRNA對(duì)靶向WNT1的miRNA的海綿功能。方法:1.提取患者全血基因組DNA,對(duì)前期實(shí)驗(yàn)室高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)的WNT1基因候選突變位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。2.構(gòu)建WNT1突變體的過表達(dá)載體,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞和Saos2細(xì)胞,分別進(jìn)行TOP-Flash實(shí)驗(yàn)、WNT1蛋白顯性負(fù)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)和Saos2細(xì)胞礦化實(shí)驗(yàn)。3.構(gòu)建circRNA熒光素酶報(bào)告載體,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,檢測(cè)circRNA對(duì)靶向WNT1的miRNA的海綿功能。結(jié)果:1.在檢測(cè)的OI患者中,9個(gè)WNT1基因的突變位點(diǎn)是未報(bào)道過的,分別為c.301CT、c.382TG、c.397GA、c.620GA、c.677CT、c.681CA、c.774CA、c.937CT、c.1010GC。并同時(shí)成功構(gòu)建其過表達(dá)載體WNT1 ~(R101C)、WNT1~(F128V)、WNT1~(A133T)、WNT1~(R207H)、WNT1~(S226L)、WNT1~(R313C)、WNT1~(R337P)、WNT1~(C227*)、WNT1~(Y258*)。2.在TOPflash實(shí)驗(yàn)中,野生型WNT1蛋白作為陽性對(duì)照,除S226L突變體外,其余突變型蛋白均與野生型蛋白有顯著性差異。3.在顯性負(fù)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中,野生型WNT1蛋白作為陽性對(duì)照,,除Y258*突變型WNT1蛋白外,其余突變型蛋白均與野生型蛋白相比,沒有顯著性差異,P0.05。4.在Saos2細(xì)胞礦化實(shí)驗(yàn)中,根據(jù)茜素紅染色結(jié)果得知突變型WNT1組較野生型WNT1組礦化能力均明顯減弱。5.hsa_circ_001308能夠與miR-148a和miR-152結(jié)合;hsa_circ_001319組中miR-152與對(duì)照組相比P=0.59,可能與circRNA1319相互作用;hsa_circ_001372與miR-148a、miR-148b和miR-152相互作用;hsa_circ_001649與miR-133a結(jié)合。結(jié)論:新檢測(cè)的WNT1突變位點(diǎn)豐富了中國(guó)OI患者突變表達(dá)譜,為研究WNT1導(dǎo)致成骨不全的致病機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)資料。TOPflash實(shí)驗(yàn)也間接反映出突變型WNT1蛋白使經(jīng)典WNT信號(hào)通路中β-catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性降低,礦化實(shí)驗(yàn)中突變型WNT1組較野生型WNT1組礦化能力均明顯減弱。體外突變體WNT1~(Y258*)似乎有輕微的顯性負(fù)效應(yīng)。pmiRGlo-circRNA1308、circRNA1372和circRNA1649能夠結(jié)合miRNA,具有miRNA海綿功能。
【圖文】：

WNT信號(hào)通路Figure1.1TheWNT1signallingpathway

圖 1.2 WNT1 蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)Figure1.2 Post-translational site of WNT1 protein1.3.2 WNT1 基因突變與 XV 成骨不全
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R681.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 查小云;胡予;;骨質(zhì)疏松相關(guān)信號(hào)通路研究進(jìn)展[J];中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志;2014年02期

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本文編號(hào)：2700938