【摘要】：目的:Micro-RNAs(miRNAs)是一種短鏈,18-24bp,高度保守的非編碼小RNA。據(jù)報(bào)道,miRNAs在人類癌癥患者血清及癌組織中表達(dá)異常,與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。骨肉瘤細(xì)胞中miR-29s的過(guò)表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。然而,迄今為止對(duì)于miR-29s在人骨肉瘤中的作用尚無(wú)充分的研究。MMPs與腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),但MMP-9在人骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)和miRNA-29b與MMP-9之間的相互作用,尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本文主要對(duì)骨肉瘤組織中miRNA-29b的表達(dá)進(jìn)行評(píng)估,并探討其對(duì)人類骨肉瘤MG-63細(xì)胞株的增殖和藥物敏感性的作用,探索外源性miR-29b對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡和化療敏感性的作用和機(jī)制,為骨肉瘤的治療提供新的參考。方法:1.人類骨肉瘤細(xì)胞系MG-63購(gòu)自于ATCC公司,在含10%胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),將培養(yǎng)皿置于CO_2為5%,溫度為37°C的細(xì)胞敷箱中進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞按照1.5×10~5/孔種植在12孔板上,繼而用濃度為30 nM miR-29b mimics和陰性對(duì)照進(jìn)行轉(zhuǎn)染。2.從質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的MG-63細(xì)胞中提取總RNA,參照試劑說(shuō)明書通過(guò)三聯(lián)試劑的進(jìn)行提純mRNA。無(wú)水RNase被用來(lái)溶解總RNA,采用瓊脂糖凝膠電泳純化提取RNA。采用q RT-PCR方法對(duì)miR-29b mRNA進(jìn)行定量分析。由NCBI查詢每個(gè)mRNA標(biāo)記的序列,premier 5設(shè)計(jì)qRT-PCR引物。MMP-9引物序列為:F:5′-ACGCAGACATCGTC ATCCAGT-3′,R:GGACCACAACTCGTCATCGTC;GAPDH引物序列為:F:5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′,R:5′-GGGGTCATTGATG GCAACAATA-3′,依據(jù)SYBR Prime Script PLUS RT-PCT試劑盒操作說(shuō)明書檢測(cè)每個(gè)樣品的mRNA相對(duì)水平。反應(yīng)后,將各標(biāo)志物的mRNA水平進(jìn)行計(jì)算,以GAPDH作為內(nèi)參。3.組織和細(xì)胞樣本立即用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液浸泡,然后12000轉(zhuǎn)/分,離心15分鐘,收集上層澄清液。用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。檢測(cè)b-actin和MMP-9,用抗人b-actin小鼠單克隆抗體,抗人caspase3小鼠單克隆抗體,抗人pro-caspase3小鼠單克隆抗體,抗人PARP小鼠單克隆抗體抗體,抗人pro-PARP小鼠單克隆抗體,抗人MMP-9小鼠單克隆抗體孵育。檢測(cè)采用辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)抗鼠IgG二抗與皮爾斯?ECL免疫斑點(diǎn)法試劑盒,利用分子成像成像儀CheminDocTMXRS系統(tǒng)檢測(cè)。4.Annexin V-PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒,檢測(cè)細(xì)胞凋亡。(阿霉素治療+miRNA轉(zhuǎn)染)處理兩天后,MG63細(xì)胞收集和磷酸鹽(PBS)沖洗,加400ul PBS稀釋到濃度為1×10~5細(xì)胞/ml,每個(gè)培養(yǎng)板加5μl Annexin V-PI和碘化普羅匹定混合,混合徹底治療細(xì)胞被放置在暗室中,進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析FACScalibur。5.轉(zhuǎn)染后,細(xì)胞計(jì)數(shù)后種植于96孔培養(yǎng)板,密度為5×10~3個(gè)細(xì)胞/孔,然后利用Kit-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒對(duì)細(xì)胞分化進(jìn)行檢測(cè),每孔加10μl CCK-8后,將培養(yǎng)板置于37℃溫箱孵育1小時(shí),在OD450下測(cè)量其濃度值。6.克隆形成實(shí)驗(yàn)主要是將MG63細(xì)胞1×10~3/孔分三次種植于6孔培養(yǎng)板上,培養(yǎng)兩周后用1%細(xì)胞結(jié)晶紫染色,觀察用奧林巴斯SH-50拍照,計(jì)數(shù)用ImageJ 1.47軟件。7.熒光素酶報(bào)告:細(xì)胞在24孔板中以70-80%的細(xì)胞濃度滴加三份,并與Gaussia Luciferase(GLuc)熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和SEAP熒光素酶質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,參照試劑使用說(shuō)明書,使用一種分泌物-對(duì)雙熒光測(cè)定試劑盒,分析了細(xì)胞培養(yǎng)基中GLuc和SEAP的活性。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)檢測(cè)三次,單因素ANOVA評(píng)估數(shù)據(jù)的顯著性,設(shè)置p0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.人骨肉瘤組織中miR-29b與MMP-9 mRNA的差異性表達(dá)首先研究了miRNA-29b水平與骨肉瘤患者臨床病理特征的相關(guān)性,miRNA-29b與骨肉瘤轉(zhuǎn)移與臨床分期相關(guān),臨床I期和II患者miRNA-29b水平比臨床III期和有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者高。我們?cè)谌斯侨饬鼋M織中檢測(cè)到miR-29b在骨肉瘤中的水平較癌旁低。相反,骨肉瘤組織中MMP-9 mRNA水平遠(yuǎn)高于癌旁。2.MG-63細(xì)胞轉(zhuǎn)染25或50n M miR-29b模擬物和miR-29b對(duì)照,24小時(shí)后,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)miR-29b與MMP-9的表達(dá)量;MG-63細(xì)胞在25和50nM miR-29b模擬物轉(zhuǎn)染下,miR-29b表達(dá)水平較miR-29b對(duì)照組提高了100倍或150倍,而MMP-9 mRNA表達(dá)水平較miR-29b對(duì)照組降低了40%或50%。利用免疫印跡檢測(cè)MMP-9蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)MMP-9表達(dá)顯著被抑制。轉(zhuǎn)染25和50nM miR-29b模擬物的MG-63細(xì)胞,MMP-9的蛋白表達(dá)水平分別下調(diào)了57%和65%。3.為了明確miR-29b與MMP-9在MG-63細(xì)胞中的相互作用機(jī)制,我們構(gòu)建了一種熒光素酶5'UTR野生或突變的MMP-9,野生或突變的5'UTR人MMP-9被插入在一個(gè)熒光素酶基因的質(zhì)粒中。MiR-29b的設(shè)計(jì)目的位置是5'UTR人MMP-9,轉(zhuǎn)染后,發(fā)現(xiàn)伴有25和50nM miR-29b模擬物的存在下,miR-29b轉(zhuǎn)染抑制了熒光素酶40%和60%的活性。然而,miR-29b對(duì)突變體5'UTR的熒光素酶MMP-9的表達(dá)沒(méi)有影響。4.為了檢測(cè)miR-29b對(duì)MG-63細(xì)胞體外生長(zhǎng)的抑制作用,MG-63細(xì)胞通過(guò)50n M miR-29b模擬物或?qū)φ辙D(zhuǎn)染,在不同時(shí)間點(diǎn)用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)。miR-29b模擬物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,在所有時(shí)間點(diǎn)上的細(xì)胞活力均較存活率最低。MG-63細(xì)胞滴加到12個(gè)孔中(每孔50個(gè)細(xì)胞)孵育12個(gè)小時(shí),然后用50nM的miR-29b模擬物或?qū)φ辙D(zhuǎn)染。然后觀察各組MG-63細(xì)胞的菌落形態(tài)。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-29b模擬物與miR-29b對(duì)照組相比,菌落的大小顯著降低。5.使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-29b對(duì)阿霉素誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡的影響。miR-29b轉(zhuǎn)染后,阿霉素誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞的凋亡率提高了37.5%。用免疫印跡技術(shù)對(duì)不同組的caspase 3或PARP進(jìn)行定量分析。MG-63細(xì)胞+阿霉素+50nm miR-29b模擬物,caspase 3的表達(dá)水平最高,miR-29b轉(zhuǎn)染提高了pro-caspase 3/caspase 3和pro-PARP/PARP的比值分別為40%和27%。結(jié)論:1.骨肉瘤組織中miR-29b水平下降,MMP-9水平升高,miR-29b在已轉(zhuǎn)移骨肉瘤和分期較晚的癌組織中高表達(dá),而MMP-9恰好相反。2.miR-29b在骨肉瘤細(xì)胞中抑制MMP-9的表達(dá)。3.miR-29b具有抑制骨肉瘤細(xì)胞分化和促進(jìn)其凋亡的作用。4.miR-29b/MMP-9可能是參與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展病理過(guò)程的重要機(jī)制。
【圖文】：

對(duì)照組 骨肉瘤組圖 1 骨肉瘤組織及正常對(duì)照組織中 miR-29b 的 mRNA 的比較Figure 1 Comparison of mRNA of mir-29b in osteosarcoma tissue and control tissues..2 miR-29b 對(duì)人骨肉瘤 MG-63 細(xì)胞分化及克隆的影響為了檢測(cè) miR-29b 對(duì)人骨肉瘤 MG-63 細(xì)胞體外生長(zhǎng)的抑制作用，人骨肉G-63 細(xì)胞通過(guò) 50nM 對(duì)照或 miR-29b mimics 轉(zhuǎn)染，在不同時(shí)間點(diǎn)用 CCK-8 檢胞生長(zhǎng)。miRNA-29b mimics 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在所有時(shí)間點(diǎn)上的細(xì)胞存活率最低， 4。人骨肉瘤 MG-63 細(xì)胞滴加到 12 個(gè)孔中(每孔 50 個(gè)細(xì)胞)孵育 12 個(gè)小時(shí)，用 50nM 的對(duì)照或 miR-29bmimics 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。然后觀察各組 MG-63 細(xì)胞的生態(tài)。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn) miRNA29b mimics 與對(duì)照組相比，斑點(diǎn)的大小顯著降低，如,3,4。.3 使用 CCK-8 檢測(cè) miR-29b 對(duì)阿霉素誘導(dǎo) MG-63 細(xì)胞凋亡的影

斑點(diǎn)的大小顯著降低，如圖2,3,4。2.3 使用 CCK-8 檢測(cè) miR-29b 對(duì)阿霉素誘導(dǎo) MG-63 細(xì)胞凋亡的影響miR-29b 轉(zhuǎn)染后人骨肉瘤 MG-63 細(xì)胞，阿霉素誘導(dǎo)的凋亡率提高了 37.5%，如圖 5,6 所示。用免疫印跡技術(shù)對(duì)不同組的凋亡相關(guān)標(biāo)志物 caspase 3 (casp3)或多腺苷二磷酸多聚酶抗原進(jìn)行定量分析。MG-63 細(xì)胞+阿霉素+ 50nm miR-29b，caspase 3 的表達(dá)水平最高，，miR-29b 轉(zhuǎn)染提高了裂解 caspase 3 和多腺苷二磷酸多聚酶抗原的比值分別為 40%和 27%，如圖 7,8。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R738.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2698551