【摘要】：研究背景:骨重塑(bone remodeling)在骨的生長(zhǎng)以及損傷修復(fù)過(guò)程中均發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)因可誘導(dǎo)異位成骨而被人類(lèi)發(fā)現(xiàn)。目前BMP-2和BMP-7已被批準(zhǔn)應(yīng)用于骨科臨床治療,但其治療效果并不顯著。所以闡明BMPs在體內(nèi)的作用機(jī)制對(duì)于提高其臨床療效至關(guān)重要。BMP信號(hào)通路的激活必須依賴(lài)于配體所誘導(dǎo)的異源性四聚體的形成,這種異源性四聚體由I型BMP受體和II型BMP受體組成。其中,I型BMP受體在BMP信號(hào)通路的激活過(guò)程中起著非常關(guān)鍵的起始作用,活化素I型受體(activin receptor type I,ACVR1)是I型BMP受體之一,當(dāng)人類(lèi)ACVR1基因p.R206H位點(diǎn)發(fā)生獲得性突變時(shí),會(huì)引起人類(lèi)進(jìn)行性肌肉骨化癥(fibrodysplasia ossificans progressiva,FOP),但卻不影響患者的內(nèi)源性骨組織。因此,闡明ACVR1所介導(dǎo)的BMP信號(hào)通路在內(nèi)源性骨組織中的作用及相關(guān)分子機(jī)制,對(duì)調(diào)控體內(nèi)骨穩(wěn)態(tài)及促進(jìn)骨再生具有非常重要的理論指導(dǎo)意義。目的:體內(nèi)探究成骨細(xì)胞內(nèi)特異性敲除ACVR1后對(duì)小鼠骨重塑的影響;體外探究小鼠前成骨細(xì)胞內(nèi)ACVR1對(duì)細(xì)胞增殖和分化的影響。材料與方法:體內(nèi)實(shí)驗(yàn):通過(guò)Cre-loxP系統(tǒng)建立成骨細(xì)胞內(nèi)特異性敲除Acvr1基因的小鼠動(dòng)物模型,在出生后21天時(shí)脫頸處死。利用TRIzol試劑提取小鼠右股骨組織內(nèi)總mRNA,實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá);利用micro-CT測(cè)量小鼠左股骨骨量的變化;小鼠左股骨經(jīng)脫鈣、脫水以及石蠟包埋后,進(jìn)行組織學(xué)切片,之后利用HE染色、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、靜態(tài)組織形態(tài)測(cè)量學(xué)等方法進(jìn)一步檢測(cè)小鼠股骨在形態(tài)學(xué)上的變化。體外實(shí)驗(yàn):體外分離并培養(yǎng)c57乳鼠的顱骨前成骨細(xì)胞,通過(guò)lipofectamine載siRNA的方法轉(zhuǎn)染和沉默細(xì)胞內(nèi)Acvr1基因的表達(dá),利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率,實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Acvr1基因的沉默效率,應(yīng)用MTT檢測(cè)Acvr1基因沉默后細(xì)胞增殖能力的改變,茜素紅染色檢測(cè)Acvr1基因沉默后細(xì)胞礦化能力的改變。結(jié)果:體內(nèi)實(shí)驗(yàn):選用Osx-Cre;Acvr1~(fx/-)基因型的雄鼠作為實(shí)驗(yàn)組,以同窩出生的Osx-Cre;Acvr1~(fx/+)基因型的雄鼠作為對(duì)照組。Micro-CT結(jié)果表明出生后21天的Acvr1 cKO小鼠股骨骨量無(wú)明顯變化,但密質(zhì)骨組織礦物質(zhì)密度和骨礦物質(zhì)密度均明顯下降,股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨骨小梁數(shù)目增多;靜態(tài)組織形態(tài)測(cè)量學(xué)分析結(jié)果表明,Acvr1 cKO小鼠股骨遠(yuǎn)端生長(zhǎng)板下方骨松質(zhì)區(qū)域與對(duì)照組相比,骨量無(wú)明顯變化,骨小梁數(shù)目增大,骨小梁分離度減小,骨小梁厚度則無(wú)改變,骨表面成骨細(xì)胞數(shù)量和成骨細(xì)胞表面增大,而破骨細(xì)胞數(shù)量和破骨細(xì)胞表面則無(wú)明顯變化;實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組小鼠成骨分化相關(guān)基因(Col1、Opn)的表達(dá)明顯增多,破骨分化相關(guān)基因(Mmp9、Ctsk、Tracp)表達(dá)無(wú)明顯差異,Wnt信號(hào)通路抑制劑(Dkk1、Sost)表達(dá)顯著升高。體外實(shí)驗(yàn):流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明lipofectamine-siRNA復(fù)合體可以成功轉(zhuǎn)染并有效沉默小鼠前成骨細(xì)胞內(nèi)Acvr1基因的表達(dá);MTT結(jié)果表明小鼠前成骨細(xì)胞內(nèi)Acvr1基因沉默后可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖能力;茜素紅染色結(jié)果表明小鼠前成骨細(xì)胞Acvr1基因沉默后可以降低細(xì)胞的礦化水平。結(jié)論:在體內(nèi):成骨細(xì)胞內(nèi)ACVR1在小鼠斷奶前對(duì)骨量的調(diào)控作用不明顯,但對(duì)骨的礦化起正性調(diào)控作用;在體外:成骨細(xì)胞內(nèi)ACVR1能夠抑制小鼠前成骨細(xì)胞的增殖,而促進(jìn)小鼠前成骨細(xì)胞的成骨向分化。
【圖文】：

圖 2.1 雄鼠（3 周齡）股骨骨量無(wú)明顯變化。（A）Micro-CT 三維重建圖片。（B-E）密質(zhì)骨參數(shù)；（F-K）松質(zhì)骨參數(shù)。對(duì)照組（Cont）n=5；實(shí)驗(yàn)組（cKO）n=5。*：p < 0.05。為了檢測(cè)小鼠股骨的組織學(xué)變化，我們對(duì)股骨遠(yuǎn)端生長(zhǎng)板下方松質(zhì)骨進(jìn)行了靜態(tài)組織形態(tài)測(cè)量學(xué)分析。分析結(jié)果表明：與對(duì)照組相比， Acvr1 cKO 組骨量無(wú)明顯變化（圖 2.2 B），但 Acvr1 cKO 組的 Tb. N 增多（圖 2.2 C）、且 Tb. Sp減�。▓D 2.2 E）；與對(duì)照組相比， Acvr1 cKO 組 N. Ob/BS 和 Ob. S/BS 均明顯增多（圖 2.2 F、G），但 N. Oc/BS 和 Oc. S/BS 在兩組小鼠中均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)改變（圖 2.2 H、I）。

圖 2.2 雄鼠（3 周齡）股骨遠(yuǎn)端組織形態(tài)測(cè)量學(xué)分析。（A）H&E 染色和 TRAP染色結(jié)果，，圖中顯示測(cè)量區(qū)域。（B-I）靜態(tài)組織形態(tài)測(cè)量學(xué)參數(shù)。對(duì)照組（Cont）n=5；實(shí)驗(yàn)組（cKO）n=5。*：p < 0.05；**: p < 0.01。2.3.2 成骨細(xì)胞內(nèi)特異性敲除 Acvr1 后導(dǎo)致成骨分化、破骨分化相關(guān)基因改變?yōu)榱藱z測(cè)成骨細(xì)胞內(nèi)特異性敲除 Acvr1 基因后，成骨分化和破骨分化標(biāo)志基因的改變，我們提取小鼠股骨總 mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA 后，實(shí)時(shí)定量RT-PCR 分別檢測(cè)成骨分化標(biāo)志基因（Runx2、Osx、Col1、Alp、Ocn、Opn）和破骨分化標(biāo)志基因（Mmp9、Ctsk、Tracp），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明僅成骨標(biāo)志基因 Col1（p<0.05）和 Opn（p<0.01）表達(dá)明顯升高。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R68

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本文編號(hào)：2695991