【摘要】：背景全心缺血再灌注損傷常見(jiàn)于體外循環(huán)下的心臟及大血管手術(shù)、心跳驟停后心肺復(fù)蘇等,缺血的心肌在循環(huán)開(kāi)放或冠脈血流恢復(fù)后,可能會(huì)加重心肌損傷,給麻醉和患者生命安全造成嚴(yán)重威脅。已有大量研究表明嗎啡預(yù)處理(morphine preconditioning,MPC)可顯著減輕局部心肌缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI),而MPC是否可減輕全心缺血再灌注導(dǎo)致的心肌損傷,其機(jī)制如何,目前尚不明確。心肌細(xì)胞死亡是很多心臟疾病的共同特征,主要包括壞死、凋亡以及細(xì)胞自噬。事實(shí)上,在心肌缺血再灌注過(guò)程中,由于壞死而損失的心肌細(xì)胞可能遠(yuǎn)大于凋亡所致的細(xì)胞死亡。冠脈流出液中乳酸脫氫酶(LDH)活性升高也是心肌壞死的重要標(biāo)志。程序性壞死(necroptosis)是一種全新的細(xì)胞死亡方式,這種細(xì)胞壞死雖然在形態(tài)學(xué)上與傳統(tǒng)意義上的壞死相似,但與細(xì)胞凋亡一樣受到體內(nèi)細(xì)胞信號(hào)通路的嚴(yán)格調(diào)控。最近研究發(fā)現(xiàn),程序性壞死在心肌IRI中發(fā)揮重要作用,而且受體相互作用蛋白(receptor interacting protein,RIP)是心肌細(xì)胞程序性壞死信號(hào)中的關(guān)鍵效應(yīng)分子。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)是重要的促生存激酶,再灌注早期激活ERK信號(hào)通路可有效促進(jìn)心肌細(xì)胞存活,縮小心肌梗死面積。我們前期研究表明MPC通過(guò)激活ERK信號(hào)通路減輕心肌IRI,本課題擬在前期研究基礎(chǔ)上,探討ERK信號(hào)通路在MPC減輕大鼠全心IRI損傷中的作用,并進(jìn)一步探究MPC是否通過(guò)活化ERK信號(hào)通路影響心肌程序性壞死信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子RIP1和RIP3表達(dá),以期初步闡明嗎啡在全心缺血再灌注損傷中發(fā)揮心肌保護(hù)作用的分子機(jī)制。方法雄性SD大鼠,體重250-300 g,隨機(jī)分為8組(n=10):對(duì)照組(CON組)、缺血再灌注組(I/R組)、缺血預(yù)處理組(IPC組)、不同濃度嗎啡預(yù)處理組(MPC0.3,1,3mM三組)、MPC+ERK抑制劑PD98059組(MPD組)、抑制劑PD98059對(duì)照組(PD組)。采用Langendorff設(shè)備進(jìn)行離體心臟全心灌注-停灌40 min、再灌注90 min方法制備大鼠全心缺血再灌注損傷(IRI)模型。除CON組心臟持續(xù)灌注K-H液外,其余各組心臟均經(jīng)歷全心灌注-停灌40 min、再灌注90 min。IPC組在缺血再灌注前,預(yù)先全心停灌5 min,再灌注K-H液5 min,共3個(gè)循環(huán);MPC各濃度組在缺血前,預(yù)先分別灌注含0.3、1、3mM嗎啡的K-H液5 min,再灌注無(wú)藥K-H液5 min,共3個(gè)循環(huán);MPD組于MPC前10 min持續(xù)灌注含有PD98059(10mM)的K-H液直至嗎啡預(yù)處理結(jié)束;PD組在相同時(shí)間點(diǎn)灌注抑制劑但不進(jìn)行嗎啡預(yù)處理或缺血預(yù)處理。灌注期間使用注水乳膠球囊置入到大鼠心臟左心室,使用Power Lab生物機(jī)能系統(tǒng)測(cè)量心臟血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)包括心率(HR)和左室發(fā)展壓(LVDP)。分別于各組心臟跳動(dòng)穩(wěn)定后收集并測(cè)量冠脈流出液,檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)活性,再灌注10 min時(shí)取下大鼠心臟提取心肌蛋白,使用Western Blot法檢測(cè)心肌ERK磷酸化水平及RIP1/3蛋白表達(dá)(n=4);再灌注90 min時(shí)取下大鼠心臟,通過(guò)TTC染色法測(cè)量梗死區(qū)(IS)、缺血危險(xiǎn)區(qū)(AAR)體積及IS/AAR比值(n=6)。結(jié)果1.成功建立大鼠全心IRI模型CON組于整個(gè)實(shí)驗(yàn)灌注過(guò)程中HR:294~369 bpm,LVDP:90~140 mm Hg;冠脈流出液:11~24 ml/min;而IR組,HR于缺血前:292~364 bpm,再灌注后:200-261 bpm;LVDP于缺血前:117~135 mm Hg,再灌注后:14~22 mm Hg;冠脈流出液于缺血前:13~25 ml/min,再灌注后:5~9 ml/min。兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),全心缺血時(shí)心臟搏動(dòng)微弱,心肌組織蒼白;TTC染色后顯示IR組心肌梗死大小明顯大于CON組(P0.05)。2.不同濃度MPC對(duì)大鼠離體心臟全心IRI的作用在大鼠離體心臟中,0.3mmol/L和1mmol/L的MPC可以顯著減輕大鼠離體心臟IRI,縮小心肌梗死面積和再灌注后冠脈流出液中LDH活性,促進(jìn)再灌注時(shí)心功能LVDP的恢復(fù),而濃度大于3mmol/L的MPC反而不能有效減輕心臟的IRI。3.MPC對(duì)ERK蛋白磷酸化以及RIP表達(dá)的影響MPC(0.3,1mM)促進(jìn)心肌組織ERK磷酸化,而抑制RIP1和RIP3的表達(dá)水平,MPC(3mM)對(duì)心肌組織ERK磷酸化以及RIP1和RIP3的水平無(wú)顯著影響。2.3 PD98059對(duì)MPC介導(dǎo)大鼠全心缺血再灌注損傷保護(hù)作用的影響在大鼠離體心臟中,MPC和經(jīng)典IPC均可顯著減輕離體心臟全心IR損傷,減小心肌梗死面積,降低冠脈流出液LDH活性,促進(jìn)再灌注時(shí)心功能的恢復(fù)。而在MPC前給予ERK抑制劑PD98059后,可阻斷MPC的心肌保護(hù)作用,提示MPC在大鼠離體心臟中發(fā)揮心肌保護(hù)作用依賴(lài)于ERK通路的活化。2.4 PD98059對(duì)MPC誘導(dǎo)大鼠心肌ERK磷酸化以及RIP的影響MPC可以顯著升高ERK的磷酸化水平,抑制RIP1和RIP3的表達(dá)。PD98059可抑制MPC誘導(dǎo)的ERK磷酸化,逆轉(zhuǎn)RIP1和RIP3的表達(dá)水平。結(jié)論在SD大鼠中,MPC可通過(guò)活化ERK通路蛋白磷酸化,繼而可能抑制下游的RIP1和RIP3表達(dá)水平,減輕離體心臟全心缺血再灌注損傷損傷。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R614

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