【摘要】：目的:1.研究mi R-19對破骨細胞分化過程的影響;2.探明mi R-19在影響破骨細胞分化中發(fā)揮調(diào)控作用的信號通路;3.尋找mi R-19作用靶點以明確其在破骨分化過程中調(diào)控相應(yīng)通路的具體機制。方法:1.通過在RAW264.7細胞系和BMM細胞中過表達和抑制mi R-19并誘導(dǎo)破骨分化,從TRAP染色結(jié)果和相關(guān)破骨分化指標(biāo)蛋白和m RNA量中了解其對破骨分化的影響,并且檢測破骨分化中mi R-19的表達量了解破骨分化對其表達的影響,通過骨板實驗檢測mi R-19對破骨細胞功能的影響;2.通過Western blot和EMSA實驗檢測mi R-19過表達中RANKL介導(dǎo)的各蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的改變,并且在分別使用AKT和NF-κB通路抑制劑干預(yù)以上過程并觀察各蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的改變,從而了解各條信號通路在mi R-19影響下于破骨分化過程中發(fā)揮的作用;3.通過免疫共沉淀檢測TRAF6泛素化的改變和對其抑制酶CYLD的檢測來研究mi R-19調(diào)控各通路的機制,并通過si-CYLD作用BMM細胞對比mi R-19與細胞作用的效應(yīng)和雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證的靶基因。結(jié)果:1.mi R-19過表達可以促進破骨細胞的分化和骨吸收功能,而抑制mi R-19的表達則會抑制破骨細胞的分化和骨吸收功能,并且生理狀況下mi R-19的表達受破骨細胞分化的調(diào)控;2.mi R-19過表達后給與RANKL刺激,NF-κB,MAPK和AKT通路的相關(guān)指標(biāo)均較對照組升高,給與AKT通路抑制劑干預(yù)后,檢測到除AKT外各通路指標(biāo)沒有明顯改變,NF-κB通路抑制劑作用后對mi R-19過表達促進的破骨分化過程有抑制作用。3.mi R-19過表達后給與RANKL刺激,TRAF6結(jié)合的泛素化指標(biāo)升高,mi R-19過表達后會抑制CYLD蛋白,同時si-CYLD作用于BMM細胞的效應(yīng)與mi R-19過表達基本一致,雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測到mi R-19會與含有CYLD-3’UTR報告載體在細胞內(nèi)特異性結(jié)合。結(jié)論:mi R-19在破骨細胞分化過程中發(fā)揮正向調(diào)控功能,其功能發(fā)揮的靶基因是CYLD,并通過抑制該蛋白的表達,從而促進TRAF6的泛素化激活并促進下游NF-κB,MAPK和AKT通路的活化發(fā)揮其正向調(diào)控能力。
【圖文】：

結(jié) 果1. miR-19 mimic 及 inhibitor 轉(zhuǎn)染 RAW264.7 細胞系為了檢測購買的商品 miR-19 mimic 和 inhibitor 的可靠件，分別在 RAW264.7 細胞系和小鼠 BMM 細胞中轉(zhuǎn)染 miRmiR-19a mimic 及 miR-19b mimic ，48 小時后提取總 RNA，通過技術(shù)檢測細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染后的 miR-19 表達量，，因 miR-19a 與 miRmiR-19 引物檢測時對兩種 RNA 無差別性，故所檢測 miRNA 如圖（1-1-A）所示，轉(zhuǎn)染 mimic 后 miR-19 表達量均明顯升高，后表達量較對照組有不同程度下調(diào)。

BMM 細胞的破骨誘導(dǎo)分化為了檢驗細胞內(nèi) miR-19 表達升高對破骨細胞分化的影響，我們先選RAW264.7 細胞系來進行研究。RAW264.7 細胞種板后分別轉(zhuǎn)染 miRNA mimic N和 miR-19a mimic 及 miR-19b mimic 后加入含 50ng/mLRANKL 和 30ng/mLM-破骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)，4 天或 5 天后固定并行 TRAP 染色，鏡下觀察(1-2-A,B,C)所示，與對照 NC 組相比，miR-19a 組和 miR-19b 形成 TRAP 陽性細≥3）在第 4 天和第 5 天時均是較多的，且形態(tài)較大。為了更加真實的模擬 miR巨噬細胞向破骨分化的過程的影響，我們選用原代 BMM 細胞來進行誘導(dǎo)試驗。細胞從小鼠體內(nèi)分離后種板，分別轉(zhuǎn)染 miRNA mimic Ncontrol 和 miR-19a mmiR-19b mimic 后誘導(dǎo)破骨，7 天后 TRAP 染色觀察結(jié)果。鏡下如圖(1-2-D,E)所對照 NC 組相比，miR-19a 組和 miR-19b 形成 TRAP 染色陽性細胞較多，且形態(tài)結(jié)果與 RAW264.7 細胞系所得 致。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R68

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本文編號：2694808