【摘要】：第一部分壓力誘導(dǎo)髓核細(xì)胞線粒體自噬及其機(jī)制研究目的:觀察壓力是否導(dǎo)致髓核細(xì)胞發(fā)生線粒體自噬。方法:取2月齡SD大鼠,水合氯醛麻醉后取腰椎間盤髓核,從中提取髓核細(xì)胞,取生長狀態(tài)良好的第二代髓核細(xì)胞在可控氣壓加壓模型裝置中加壓0 h、12 h、24 h、48h。H2DCFH-DA探針檢測線粒體ROS情況,JC-1探針檢測線粒體膜電位變化,ATP檢測試劑盒檢測線粒體ATP變化,NAO染色檢測線粒體質(zhì)量改變,Western blot檢測TOM20變化情況,TOM20和LC3B染色激光共聚焦下觀察線粒體自噬情況。采用TEM觀察壓力處理的髓核細(xì)胞線粒體自噬變化情況,采用PCR、western blot檢測線粒體自噬關(guān)鍵蛋白PINK1、Parkin基因及蛋白表達(dá)變化,免疫組化結(jié)果檢測人正常椎間盤和退變椎間盤中PINK1、Parkin變化。結(jié)果:壓力處理的大鼠髓核細(xì)胞出現(xiàn)時間梯度依賴性的線粒體功能紊亂和質(zhì)量下降。Baf-A1作為一種自噬抑制劑,可阻止壓力誘導(dǎo)的線粒體數(shù)量減少。TOM20和LC3B共定位顯示隨著加壓時間延長,髓核細(xì)胞線粒體和自噬關(guān)鍵蛋白LC3B結(jié)合增多。透射電鏡下觀察可見壓力誘導(dǎo)大鼠髓核細(xì)胞線粒體被自噬體結(jié)構(gòu)包繞。PCR、western blot結(jié)果表示壓力可導(dǎo)致髓核細(xì)胞線粒體自噬關(guān)鍵蛋白PINK1、Parkin基因及蛋白表達(dá)增高(P0.05)。免疫組化結(jié)果顯示人退變椎間盤中PINK1、Parkin表達(dá)比正常椎間盤明顯增加。結(jié)論:壓力導(dǎo)致髓核細(xì)胞發(fā)生PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬。線粒體自噬關(guān)鍵蛋白PINK1、Parkin在退變椎間盤中高度表達(dá)。線粒體自噬可能參與椎間盤退行性變進(jìn)程。調(diào)控線粒體自噬可能為治療椎間盤退行性變疾病的新靶點。第二部分壓力誘導(dǎo)髓核細(xì)胞線粒體自噬與程序性壞死關(guān)系的實驗研究目的:探討壓力誘導(dǎo)髓核細(xì)胞線粒體自噬與壞死性凋亡的關(guān)系,同時驗證壓力誘導(dǎo)髓核細(xì)胞線粒體自噬的機(jī)制。方法:從2月齡大鼠腰段椎間盤內(nèi)提取髓核細(xì)胞培養(yǎng),取第2代大鼠髓核細(xì)胞。使用線粒體自噬抑制劑CsA、Mdivi-1和Parkin Si RNA抑制線粒體自噬后,碘化丙啶(Propidium iodide,PI)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞壞死率,western blot檢測細(xì)胞HMGB1釋放率,LDH檢測試劑盒檢測乳酸脫氫酶釋放情況。同時,采用線粒體自噬抑制劑CsA抑制線粒體自噬后,檢測髓核細(xì)胞線粒體功能變化;采用線粒體自噬抑制劑Mdivi-1抑制線粒體自噬后,western blot檢測細(xì)胞AIF表達(dá),激光共聚焦檢測AIF細(xì)胞核表達(dá)變化。1 MPa壓力條件下培養(yǎng)大鼠髓核細(xì)胞0 h、12 h、24 h、48 h,加入熒光探針Fluo-3AM后流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡觀察壓力誘導(dǎo)髓核細(xì)胞內(nèi)鈣水平變化。使用細(xì)胞外鈣離子螯合劑EGTA、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑Salubrinal、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣通道抑制劑2-APB或dantrolene處理細(xì)胞后觀察壓力條件下細(xì)胞鈣變化。使用鈣抑制劑BAPTA-AM抑制鈣水平后western blot觀察細(xì)胞壞死情況及髓核細(xì)胞內(nèi)線粒體質(zhì)量和細(xì)胞自噬水平的變化情況。同時,為了檢測鈣介導(dǎo)的線粒體自噬機(jī)制,采用western blot方法檢測BAPTA-AM對壓力誘導(dǎo)下髓核細(xì)胞PINK1、Parkin的表達(dá)影響。結(jié)果:自噬抑制劑和Parkin Si RNA均可顯著降低壓力誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞PI攝取率增加,抑制線粒體自噬可抑制細(xì)胞釋放HMGB1及LDH。CsA可明顯改善細(xì)胞線粒體功能紊亂發(fā)生和活性氧的升高。同時,線粒體自噬抑制劑Mdivi-1顯著抑制AIF由線粒體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核。1 MPa壓力條件下大鼠髓核細(xì)胞培養(yǎng)12 h、24 h、48 h,髓核細(xì)胞內(nèi)鈣水平與對照組相比均明顯增高(P0.05)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑Salubrinal、鈣通道抑制劑2-APB可顯著抑制壓力誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞鈣水平升高。鈣抑制劑BAPTA-AM減少髓核細(xì)胞壞死率。使用鈣抑制劑BAPTA-AM抑制鈣水平后髓核細(xì)胞線粒體自噬情況明顯減少。同時,細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬相關(guān)蛋白(PINK1,Parkin)表達(dá)減少(P0.05)。結(jié)論:壓力應(yīng)激條件下線粒體自噬參與壓力誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞程序性壞死。在壓力誘導(dǎo)髓核細(xì)胞損傷過程中線粒體自噬與程序性壞死是緊密相關(guān)的,抑制線粒體自噬可抑制壓力誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞程序性壞死。AIF線粒體至細(xì)胞核轉(zhuǎn)移及線粒體功能紊亂參與線粒體自噬介導(dǎo)的髓核細(xì)胞程序性壞死。壓力導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IP3R鈣通道開放,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放至胞質(zhì)。胞質(zhì)鈣參與壓力誘導(dǎo)髓核細(xì)胞線粒體自噬。鈣抑制劑BAPTA-AM可抑制線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1、Parkin表達(dá)水平,從而抑制線粒體自噬,減緩細(xì)胞壞死,保護(hù)髓核細(xì)胞。
【圖文】：

可控氣壓加壓細(xì)胞培養(yǎng)裝置

圖 1.2 壓力誘導(dǎo)髓核細(xì)胞線粒體功能障礙A. NP 細(xì)胞受壓時間為 0 h、12 h、24 h、4儀測定 ROS 水平。B. 用 MMP 敏感染料 強度與綠色熒光比，從而測定線粒體膜電中 ATP 水平變化的定量分析。 (*P<0.05,*
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R681.55

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 王志舒;譚曉榮;劉洹洹;;線粒體自噬調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通報;2015年06期

2 ;IL-1beta sensitizes rat intervertebral disc cells to Fas ligand mediated apoptosis in vitro[J];Acta Pharmacologica Sinica;2007年10期

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本文編號：2694179