【摘要】：背景:毛乳頭(dermalpapilla,DP)是毛囊底部具有高度特異性的成纖維細(xì)胞團(tuán),能夠分泌多種生長(zhǎng)因子,參與調(diào)控毛囊的形態(tài)發(fā)生及生長(zhǎng)周期。在體外培養(yǎng)的低代DPC(dermalpapillacell)仍具有誘導(dǎo)毛囊再生的能力。隨著體外培養(yǎng)傳代次數(shù)的增加,DPC逐漸喪失其生物學(xué)特性和功能。因此,確保高傳代毛乳頭細(xì)胞在體外培養(yǎng)的條件下仍保持誘導(dǎo)毛囊再生的功能是重建組織工程毛囊的關(guān)鍵。我們認(rèn)為通過(guò)建立新生鼠脫細(xì)胞真皮(acellular dermal matrix,ADM)三維培養(yǎng)模型可獲得大量有生物學(xué)功能的DPC,為重建組織工程毛囊提供充足的種子細(xì)胞。目的:(1)構(gòu)建新生鼠脫細(xì)胞真皮三維培養(yǎng)模型(2)對(duì)新生鼠脫細(xì)胞真皮三維培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞進(jìn)行生物特性及功能相關(guān)的檢測(cè)和評(píng)價(jià)(3)利用新生鼠脫細(xì)胞真皮三維培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)移植誘導(dǎo)毛囊重建。方法·:(1)構(gòu)建新生鼠脫細(xì)胞真皮三維培養(yǎng)模型采用物理和化學(xué)結(jié)合的方法將新生鼠真皮進(jìn)行脫細(xì)胞。采用解剖法和膠原酶消化法對(duì)成年鼠觸須DPC進(jìn)行分離和培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察二維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞形態(tài)。(2)對(duì)新生鼠脫細(xì)胞真皮三維培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞進(jìn)行生物特性及功能相關(guān)的檢測(cè)和評(píng)價(jià)生物學(xué)特性檢測(cè):采用qRT-PCT法檢測(cè)毛乳頭細(xì)胞特異性標(biāo)記物ALP和Versican的基因表達(dá)水平;采用免疫熒光法和免疫印跡法檢測(cè)ALP和Versican蛋白的表達(dá)情況。(3)利用新生鼠脫細(xì)胞真皮三維培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)移植誘導(dǎo)毛囊重建生物學(xué)功能檢測(cè):利用DPC和新生鼠表皮細(xì)胞按照以下分組混合后進(jìn)行體內(nèi)移植。移植后2周取材,對(duì)移植物進(jìn)行大體觀察和HE染色檢測(cè)。結(jié)果:(1)構(gòu)建新生鼠脫細(xì)胞真皮三維培養(yǎng)模型經(jīng)過(guò)物理結(jié)合化學(xué)方法脫細(xì)胞獲得的ADM,經(jīng)DAPI染色,沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞核藍(lán)染;經(jīng)HE染色也不見(jiàn)細(xì)胞核藍(lán)染。電鏡下觀察ADM纖維結(jié)構(gòu)呈網(wǎng)格狀排列。(2)對(duì)新生鼠脫細(xì)胞真皮三維培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞進(jìn)行生物特性及功能相關(guān)的檢測(cè)和評(píng)價(jià)qRT-PCR、免疫熒光染色和免疫印跡檢測(cè)結(jié)果表明:高代DPC在常規(guī)二維培養(yǎng)條件下,ALP和Versican表達(dá)下調(diào),而高代DPC在ADM上培養(yǎng)后能恢復(fù)ALP和Versican的表達(dá)。(3)利用新生鼠脫細(xì)胞真皮三維培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)移植誘導(dǎo)毛囊重建將2D-P8-DPC與新鮮表皮細(xì)胞聯(lián)合移植未能重建出毛囊。將2D-P3-DPC或者3D-P8-DPC與新鮮表皮細(xì)胞聯(lián)合移植后均能重建出毛囊。結(jié)論:(1)通過(guò)物理結(jié)合化學(xué)方法脫細(xì)胞可獲得ADM,用于培養(yǎng)DPC。(2)通過(guò)ADM三維培養(yǎng)的高代DPC可恢復(fù)表達(dá)細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物ALP和Versican的表達(dá)。(3)通過(guò)ADM三維培養(yǎng)的DPCs不僅恢復(fù)誘導(dǎo)毛囊再生的能力,可用于體內(nèi)移植進(jìn)行毛囊重建。
【圖文】：

ＡＤＭ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋（ｒｉｇｈｔ邋ｐａｎｅｌ）邋Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒｓ：邋２００逡逑２．邋ＡＤＭ及二維和三維培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察逡逑為了了解ＡＤＭ表面結(jié)構(gòu)，掃面電鏡下觀察。如圖１－２Ａ所示，ＡＤＭ上面逡逑觀，可見(jiàn)縱橫交錯(cuò)的網(wǎng)格狀纖維排列。逡逑為了觀察ＤＰＣ在不同培養(yǎng)條件下形態(tài)學(xué)的改變，首先在低倍鏡下觀察，可逡逑見(jiàn)二維培養(yǎng)的ＤＰＣ向四周伸展，表面積較大。而三維培養(yǎng)的ＤＰＣ呈長(zhǎng)梭形，與逡逑成纖維細(xì)胞相似，表面積較二維培養(yǎng)小，細(xì)胞聚集生長(zhǎng)（圖１－２Ｂ）。為了進(jìn)一步逡逑觀察細(xì)胞形態(tài)，掃描電鏡下觀察可見(jiàn)二維培養(yǎng)的ＤＰＣ向四周伸出多個(gè)觸角，細(xì)逡逑胞扁平，可見(jiàn)細(xì)胞核輪廓，而三維培養(yǎng)的ＤＰＣ形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞聚集生長(zhǎng)，逡逑且可觀察到細(xì)胞堆疊生長(zhǎng)的形態(tài)（圖１－２Ｃ）。逡逑７逡逑

通過(guò)ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)與ＤＰＣ生物學(xué)特性相關(guān)的細(xì)胞標(biāo)記物ＡＬＰ的ｍＲＮＡ在各逡逑組中的基因表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)分為３組：二維培養(yǎng)第３代ＤＰＣ邋（２Ｄ－Ｐ３－ＤＰＣ）；二維逡逑培養(yǎng)第８代ＤＰＣ邋（２Ｄ－Ｐ８－ＤＰＣ）；三雒培養(yǎng)第８代（３Ｄ－Ｐ８－ＤＰＣ）。如圖２－１所示，逡逑ＡＬＰ在各組之間的表達(dá)量存在顯著性差異。其中２Ｄ－Ｐ３與２Ｄ－Ｐ８組相比，，差異具逡逑有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。２Ｄ－Ｐ３與３Ｄ－Ｐ８組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)意義。逡逑通過(guò)ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)與ＤＰＣ生物學(xué)特性相關(guān)的細(xì)胞標(biāo)記物Ｖｅｒｓｉｃａｎ的ｍＲＮＡ在逡逑各組中的基因表達(dá)水平。如圖２－１所示，Ｖｅｒｓｉｃａｎ在各組之間的表達(dá)量存在顯著逡逑性差異。其中２Ｄ－Ｐ３與２Ｄ－Ｐ８組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。２Ｄ－Ｐ３與３Ｄ－Ｐ８組相逡逑比，差異具有統(tǒng)計(jì)意義。逡逑５邐ｍ邋２ＤＰ３邋＿邋２ＤＦ８邋□邋／＞ＣＭＰ８逡逑３０００－逡逑＊＊逡逑ｈ＿逡逑｜邋１０００邋ｉｊｉ邐＊逡逑0＿邋一：丨W丁趣邐；：｜：｜：邋丁灥逡逑ｙ邋＾逡逑圖２－１二維和三維培養(yǎng)ＤＰＣ的標(biāo)記物基因表達(dá)水平。與ＤＰＣ誘導(dǎo)能力相關(guān)的標(biāo)記物ＡＬＰ和逡逑Ｖｅｒｓｉｃａｎ的基因表達(dá)水平。ＡＬＰ和Ｖｅｒｓｉｃａｎ的表達(dá)水平在ＡＤＭ－Ｐ８－ＤＰＣＳ組中均較高。陽(yáng)性對(duì)逡逑照：二維培養(yǎng)第３代ＤＰＣ邋（２Ｄ－Ｐ３－ＤＰＣ）；陰性對(duì)照：二維培養(yǎng)第８代ＤＰＣ邋（２Ｄ－Ｐ８－ＤＰＣ）；逡逑實(shí)驗(yàn)組：三維培養(yǎng)第８代（３Ｄ－Ｐ８－ＤＰＣ）。與２Ｄ－Ｐ８－ＤＰＣＳ相比，＊ｏｒ＊＊ｐ＜０．０５。ｎ＝３。逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ邋ｇｅｎｅｓ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R622

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本文編號(hào)：2694116