發(fā)布時間：2020-05-31 22:58

【摘要】：研究背景與目的:自從1996年脊柱外科領(lǐng)域權(quán)威雜志《SPINE》上發(fā)表關(guān)于腰痛作為人類世紀(jì)難題的文章,腰痛也越來越引起大家的重視,椎間盤變性引起的慢性背痛和頸肩痛是威脅人類健康的嚴(yán)重問題,目前沒有有效的治療方法。慢性腰背部疼痛是造成勞動力喪失的常見原因。對于嚴(yán)重的椎間盤退行性病變的患者,目前主要采用手術(shù)治療為主的治療方法:腰椎間融合,人工椎間盤置換術(shù),微創(chuàng)髓核摘除術(shù)等。手術(shù)治療可以一定程度的減輕患者的癥狀,但手術(shù)合并很多并發(fā)癥,例如相鄰節(jié)段椎間盤退變加重,椎間隙感染等,這常常需要進(jìn)一步的外科手術(shù)。雖然手術(shù)可以減輕臨床癥狀,但既不阻止變性的進(jìn)展,也不能恢復(fù)椎間盤(Intervertebral disc,IVD)的天然功能狀態(tài)�；谏鲜鐾饪聘蓴_的情況和限制,因此,在探尋椎間盤退變機制及尋求無創(chuàng)治療的研究一直并未停止。椎間盤退變是復(fù)雜的多因素過程,雖然做了長期大量的研究工作,其確切機制并未完全了解。當(dāng)前研究以炎癥通路為主,大量研究表明退變的椎間盤細(xì)胞能產(chǎn)生炎性介質(zhì),包括:TNF-α,IL-1α/β,IL-6,IL-10和IFN-γ等等。這些因子導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)基質(zhì)降解,趨化因子的產(chǎn)生和細(xì)胞表型的改變。由此導(dǎo)致了基質(zhì)成分分解和合成之間出現(xiàn)嚴(yán)重不平衡最終導(dǎo)致椎間盤退變。炎癥因子對椎間盤細(xì)胞的作用并不存在疾病特異性,具有的局限性,轉(zhuǎn)化效益差等椎間盤是人體中最大的無血管組織。椎間盤由內(nèi)層的富含水和膠原的髓核和外層富含纖維的纖維環(huán)兩部分組成。椎間盤退變的特征在于細(xì)胞外基質(zhì)中主要成分II型膠原和蛋白聚糖的含量明顯較少,直接導(dǎo)致與水結(jié)合能力的降低,椎間盤含水量減少,髓核細(xì)胞數(shù)量減少,被成纖維細(xì)胞樣表型的細(xì)胞的替換。椎間盤作為特殊的軟骨組織,其退變過程可能與骨化相關(guān)基因有著密切的聯(lián)系。課題組在前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有報道關(guān)于骨化相關(guān)基因RUNX2能夠引起椎間盤退變。TWIST作為骨化相關(guān)基因的重要一員,參與早期抑制RUNX2調(diào)控成骨細(xì)胞化�；谏鲜鰞�(nèi)容,我們推測在椎間盤退變中,TWIST基因也起著至關(guān)重要的作用。第一部分:TWIST基因在髓核組織中的表達(dá)目的:研究TWIST基因在人髓核組織中的表達(dá)情況。方法:(1)利用GEO數(shù)據(jù)庫,生物信息學(xué)篩選椎間盤退變中骨化相關(guān)基因。(2)收集2016年3月-2017年6月因腰突癥于我院行腰椎手術(shù)的患者的椎間盤標(biāo)本,根據(jù)磁共振Pfirrmann分級系統(tǒng),I-II級為輕度退變對照組,III-V級為重度退變退變組。共采集患者標(biāo)本32例,其中對照組12例,退變組20例。對收集的椎間盤組織進(jìn)行鑒定。(3)對椎間盤組織細(xì)胞針對篩選的骨化相關(guān)基因進(jìn)行免疫組化。(4)椎間盤組織RNA提取及驗證,通過實時定量PCR的檢測方式明確骨化基因在椎間盤退變中的表達(dá)。結(jié)果:(1)骨化相關(guān)IBSP、ENPP、OPN等在椎間盤退變網(wǎng)路中存在,提示骨化相關(guān)基因在椎間盤退變中可能具有重要地位。(2)經(jīng)組織學(xué)鑒定,椎間盤退變程度與Pfirrmann分級一致,分組合理。(3)組化顯示成骨相關(guān)基因均呈不同程度的上調(diào),而骨化抑制相關(guān)基因中TWIST1及TWIST2能夠隨著退變逐漸下調(diào)。(4)通過椎間盤髓核組織的RNA檢測結(jié)果顯示TWIST1及TWIST2確實如組化所示在退變中出現(xiàn)明顯下調(diào)。結(jié)論:我們利用GEO數(shù)據(jù)庫、椎間盤標(biāo)本免疫組化、椎間盤組織RNA提取與驗證對退變椎間盤中骨化基因進(jìn)行檢測,明確骨化相關(guān)基因在退變椎間盤中異常表達(dá),TWIST1及TWIST2在退變椎間盤中明顯下調(diào)。第二部分:TWIST基因在人髓核細(xì)胞退變過程中的作用目的:研究TWIST基因在人髓核細(xì)胞中的表達(dá)情況。方法:(1)收集2016年5月-2017年7月因脊柱外傷或脊柱側(cè)彎等患者的Pfirrmann分級I-II級的椎間盤組織,進(jìn)行原代人髓核細(xì)胞培養(yǎng)。(2)通過TWIST1及2基因全長PCR將TWIST表達(dá)CDS區(qū)純化、克隆入表達(dá)載體,并于髓核細(xì)胞中利用轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行TWIST1及2基因的過表達(dá),構(gòu)建TWIST的過表達(dá)及干擾載體。(3)利用炎癥因子IL-1β與TNF-α進(jìn)行體外髓核細(xì)胞的炎性刺激,構(gòu)建體外髓核細(xì)胞退變模型。(4)通過轉(zhuǎn)染TWIST1/TWIST2過表達(dá)及干擾載體于髓核細(xì)胞中,培養(yǎng)24h后通過Real-time PCR檢測處理后髓核細(xì)胞ECM降解相關(guān)MMP、ADAMTS的表達(dá)情況明確退變情況。(5)同上處理后通過Western Blot檢測處理后髓核細(xì)胞ECM相關(guān)CHSY、MMP、ADAMTS等酶的表達(dá)情況。結(jié)果:(1)通過原代培養(yǎng)髓核組織,成功建立體外髓核細(xì)胞系6株。(2)檢測細(xì)胞TWIST1及2的表達(dá)發(fā)現(xiàn)確實出現(xiàn)上調(diào),提示過表達(dá)及干擾載體構(gòu)建成功。(3)通過檢測發(fā)現(xiàn)刺激后髓核細(xì)胞CHSY、ACAN、II型膠原等基質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)減少,基質(zhì)降解相關(guān)MMP、ADAMTS表達(dá)顯著增加,體外模型構(gòu)建成功。(4)過表達(dá)TWIST1及2基因,髓核細(xì)胞CHSY、ACAN、II型膠原等基質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)較對照組顯著增加,基質(zhì)降解相關(guān)MMP、ADAMTS表達(dá)顯著減少。結(jié)論:我們通過髓核細(xì)胞原代培養(yǎng)、構(gòu)建TWIST過表達(dá)載體、構(gòu)建體外退變模型、轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體等方法,明確TWIST基因在體外確實具有抑制椎間盤退變,保護(hù)椎間盤的作用。第三部分:TWIST基因保護(hù)椎間盤退變的機制研究目的:研究TWIST基因保護(hù)椎間盤退變的機制研究。方法:(1)構(gòu)建RUNX2過表達(dá)及干擾載體。(2)于人髓核細(xì)胞中過表達(dá)RUNX2基因并檢測ECM相關(guān)CHSY、MMP、ADAMTS等酶的表達(dá)情況。(3)利用共轉(zhuǎn)染的方式將TWIST與RUNX2于退變髓核中共表達(dá),檢測ECM相關(guān)CHSY、MMP、ADAMTS等酶的表達(dá)情況。(4)構(gòu)建RUNX2啟動子雙熒光報告載體,檢測TWIST過表達(dá)后RUNX2啟動子的活性情況。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建RUNX2過表達(dá)及干擾載體。(2)RUNX2過表達(dá)后髓核基質(zhì)合成相關(guān)ACAN、COL2A1等基因出現(xiàn)顯著下調(diào),提示其具有促進(jìn)退變發(fā)生的作用。(3)共轉(zhuǎn)染TWIST與RUNX2于退變髓核后,RUNX2基因引起的促退變效應(yīng)出現(xiàn)一定程度上的緩解。(4)利用雙熒光素酶報告基因檢測過表達(dá)TWIST后對RUNX2下游功能的影響,發(fā)現(xiàn)TWIST能夠顯著抑制RUNX2的活性。結(jié)論:我們通過構(gòu)建RUNX2過表達(dá)及干擾載體、共轉(zhuǎn)染TWIST與RUNX2、雙熒光素酶報告基因檢測等方法,進(jìn)一步明確TWIST制椎間盤退變,保護(hù)椎間盤的作用主要是通過抑制RUNX2的活性來實現(xiàn)的。
【圖文】：

軍醫(yī)大學(xué)碩 學(xué)位論文、結(jié)果一）樣本收集情況在第二軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)下，課題組利用長征醫(yī)院脊柱微創(chuàng)中心的病行標(biāo)本收集。所有標(biāo)本均取自腰椎手術(shù)，，按照Pfirrmann分級標(biāo)準(zhǔn)對標(biāo)本進(jìn)行分組，表1-1），其中Pfirrmann分級I-II級為輕度退變對照組，III-V級為重度退變退變采集患者標(biāo)本32例，男17例，女15例，年齡25-55歲，平均年齡42.5歲。經(jīng)統(tǒng)計對照組12例，納入退變組共20例，患者基本情況如下（表1-2）。通過術(shù)中收集間盤的髓核組織，用于后續(xù)實驗。

達(dá)網(wǎng)絡(luò)（圖1-5），分析中我們發(fā)現(xiàn)骨化相關(guān)IBSP、ENPP、OPN等在椎間盤退變網(wǎng)路中存在，提示骨化相關(guān)基因在椎間盤退變中可能具有重要地位。圖1-2 聚類分析篩選差異基因。紅色為相對表達(dá)升高的基因，而綠色為相對表達(dá)降低的基因，從上圖顯示IDD與IVD相比存在較大基因表達(dá)差異。圖1-3 根據(jù)基因在退變及非退變組中表達(dá)差異進(jìn)行分類后的GO分析。左圖示退變中出現(xiàn)明顯上調(diào)基因的GO分析情況，右圖示退變中出現(xiàn)明顯下調(diào)的基因GO分析情況。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R681.5

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3 劉q

本文編號：2690589