【摘要】：研究背景急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)是由肺內(nèi)或肺外因素引起的,以頑固性低氧血癥為顯著特征的臨床綜合征。ARDS在燒傷創(chuàng)傷等重癥ICU患者中發(fā)生率高,死亡率高,救治難度大,是臨床面臨的普遍難題,也是臨床和基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)話題�；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),ARDS發(fā)病機(jī)制是全身失衡的炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的肺實(shí)質(zhì)性損傷,其中炎癥因子尤其是炎癥因子的級聯(lián)放大效應(yīng)發(fā)揮了重要作用。ARDS發(fā)生過程中產(chǎn)生的炎癥因子,部分可成為獨(dú)立損傷因素,參與ARDS的發(fā)生發(fā)展。CD74是細(xì)胞膜上一種由232個氨基酸組成的單次跨膜受體蛋白,膜上CD74能夠和巨噬細(xì)胞移動抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)相互結(jié)合參與ARDS的發(fā)生發(fā)展。膜上CD74蛋白分為三段結(jié)構(gòu),其中1-46位氨基酸位于細(xì)胞膜內(nèi),47-72位氨基酸是跨膜序列,73-232位氨基酸位于細(xì)胞膜外被稱為膜外段。可溶型CD74分子(soluble CD74,sCD74)是CD74分子的細(xì)胞膜外段。2014年耶魯大學(xué)的Richard Bucala教授團(tuán)隊在自身免疫性肝病中首次報道了sCD74的存在,初步證實(shí)了sCD74在免疫疾病中的重要作用。Kim團(tuán)隊也發(fā)現(xiàn)了非存活的燒傷患者的血清中,sCD74在燒傷后12h時含量較低,但24h后開始逐漸升高。我們實(shí)驗團(tuán)隊前期對sCD74做了部分研究,發(fā)現(xiàn)在ARDS小鼠模型中,小鼠外周血清和肺泡灌洗液中均存在sCD74,并且sCD74的含量和ARDS的嚴(yán)重程度成正相關(guān)。此外,小鼠肺泡灌洗液中sCD74含量和炎癥因子TNF-α、IL-6含量呈正向回歸關(guān)系。在臨床研究中發(fā)現(xiàn),ARDS患者早期血清中sCD74水平顯著升高,并且升高的sCD74和ARDS患者不良預(yù)后密切相關(guān)。這些結(jié)果均提示sCD74可能參與ARDS發(fā)生和進(jìn)展過程。那么其在ARDS過程中究竟扮演什么樣的角色?是否和其他炎癥因子一樣作為獨(dú)立損傷因素加重肺損傷?目前還沒有相關(guān)文獻(xiàn)報道。因此本課題分別在體內(nèi)和體外證實(shí)了sCD74能促進(jìn)小鼠肺組織和肺相關(guān)細(xì)胞的炎癥反應(yīng),并初步探討了其可能的機(jī)制,證實(shí)sCD74是通過激活炎癥經(jīng)典信號通路NF-κB來促進(jìn)炎癥反應(yīng)的。第一部分:sCD74氣道滴入誘發(fā)小鼠炎癥反應(yīng)(體內(nèi)實(shí)驗)研究目的:在動物水平探究sCD74是否促進(jìn)小鼠肺組織發(fā)生炎癥反應(yīng)研究方法:通過氣道滴入方式探究sCD74對小鼠肺組織的影響,根據(jù)sCD74刺激作用時間的不同分為2h、6h、8h、12h、24h組,根據(jù)sCD74刺激劑量不同分為0.01、0.1、0.5、1、2mg/kg等濃度梯度,同時加入Ig-Fc蛋白作為實(shí)驗對照,在指定時間內(nèi)收取小鼠外周血清、肺組織、肺泡灌洗液等標(biāo)本。采用RT-PCR法檢測肺組織炎癥基因相對表達(dá)量;通過ELISA法檢測肺泡灌洗液中炎癥因子的含量;通過BCA蛋白定量法檢測肺泡灌洗液中總蛋白含量;通過肺干濕比探究肺水腫程度;通過HE染色了解肺大體損傷情況;通過ELISA法檢測外周血清中炎癥因子含量。研究結(jié)果:肺組織炎癥基因TNF-α、MIP-2和IL-6在0.5mg/kg sCD74氣道滴入2h后分別增高2.1、3.4和2.8倍,之后炎癥基因逐漸降至正常對照水平。肺泡灌洗液中炎癥因子TNF-α、MIP-2含量隨時間變化先增高后下降,8h是炎癥因子分泌的高峰點(diǎn),分別為560pg/ml和107 pg/ml。在濃度效應(yīng)上,炎癥基因相對表達(dá)量和炎癥因子含量和氣道滴入濃度存在依賴關(guān)系。sCD74和Ig-Fc蛋白相比在促進(jìn)炎癥基因的高表達(dá)和炎癥因子的分泌方面都有統(tǒng)計學(xué)差異。氣道滴入sCD74后小鼠肺泡灌洗液中總蛋白含量、肺組織干濕比和外周血清炎癥因子和對照組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異,肺HE染色顯示無明顯損傷。研究結(jié)論:氣道滴入sCD74能夠引起小鼠肺局部的炎癥基因高表達(dá)和相應(yīng)的炎癥因子的分泌,但對于肺整體的炎性損傷作用和全身炎癥反應(yīng)影響較小。第二部分:sCD74誘導(dǎo)肺相關(guān)細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)(體外實(shí)驗)研究目的:在細(xì)胞水平探究sCD74是否促進(jìn)肺相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)研究方法:分別選用RAW264.7作為肺巨噬細(xì)胞代表,A549作為肺上皮細(xì)胞代表,HUVEC作為肺血管內(nèi)皮細(xì)胞代表,在三種細(xì)胞系中探究sCD74的生物學(xué)作用。根據(jù)sCD74和細(xì)胞共孵育時間不同分為2h、8h、12h、24h組,根據(jù)和細(xì)胞共孵育sCD74濃度的不同分為10、100、1000ng/ml組,在相應(yīng)的時間內(nèi)收集細(xì)胞和細(xì)胞上清。采用RT-PCR法分析細(xì)胞中炎癥基因的相對表達(dá)量,采用ELISA法檢測細(xì)胞上清中炎癥因子的分泌情況。研究結(jié)果:1000ng/ml sCD74刺激巨噬細(xì)胞,在2h時炎癥基因TNF-a、MIP-2和IL-6相對表達(dá)量增高最明顯,分別增高4.0、11.8、2.6倍,之后炎癥基因逐漸降至正常對照水平。巨噬細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-a和MIP-2含量隨著刺激時間的延長和刺激濃度的增高而增加。sCD74能夠在8h時刺激A549和HUVEC細(xì)胞炎癥基因TNF-a和IL-6高表達(dá),但對炎癥因子的分泌無影響。研究結(jié)論:sCD74能夠促進(jìn)肺相關(guān)細(xì)胞炎癥基因表達(dá)增加,同時也能刺激巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子增多。第三部分:sCD74調(diào)控肺炎癥反應(yīng)機(jī)制的探究研究目的:1.探究sCD74促進(jìn)炎癥反應(yīng)的信號通路。2.sCD74細(xì)胞膜受體的初步探究。研究方法:1000ng/ml sCD74刺激巨噬細(xì)胞0、10、30min后分別提取胞質(zhì)和胞核蛋白,采用Western Blotting檢測胞質(zhì)中IκB、phosphate-IκB、P65、phosphate-P65和胞核中phosphate-P65蛋白表達(dá)情況。采用BAY11-7082預(yù)處理巨噬細(xì)胞30min后,再重復(fù)上述實(shí)驗,檢測檢測上述信號通路蛋白表達(dá)的變化。采用BAY11-7082預(yù)處理巨噬細(xì)胞30min后,1000ng/ml sCD74刺激巨噬細(xì)胞24h,用ELISA法檢測細(xì)胞上清中炎癥因子分泌的變化。在A549、HUVEC、HEK293、Jurkat、RBL和RAW264.7等細(xì)胞系中,采用流式細(xì)胞技術(shù)分析hsCD74和它們細(xì)胞膜的結(jié)合情況。研究結(jié)果:sCD74刺激巨噬細(xì)胞后,細(xì)胞質(zhì)中phosphate-IκB、phosphate-P65和細(xì)胞核中phosphate-P65蛋白含量明顯增多。NF-κB通路抑制劑處理后上述增高的通路蛋白又明顯降低。BAY11-7082預(yù)處理巨噬細(xì)胞能夠有效抑制sCD74分泌炎癥因子。hsCD74能夠以劑量依賴的方式和多種人源性細(xì)胞(A549、HUVEC、HEK293、Jurkat)膜結(jié)合,hsCD74不能和大鼠源性(RBL)和小鼠源性(RAW264.7)細(xì)胞膜結(jié)合。研究結(jié)論:sCD74能通過激活NF-κB通路促進(jìn)肺炎癥反應(yīng)的發(fā)生。hsCD74能夠和多種人源性細(xì)胞細(xì)胞膜結(jié)合。
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海軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文實(shí)驗結(jié)果一、sCD74 氣道滴入后小鼠肺組織中炎癥基因的表達(dá)情況為了明確 sCD74 是否會導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)，氣道滴入的方式給予 sCD74（0.5mg/kg 體重）處理小鼠不同時間（0，2，6，8，12，24h），采用 RT-PCR 的方法檢測小鼠肺組織中炎癥基因 mRNA 的表達(dá)情況。結(jié)果如圖 1 所示，與對照組相比，sCD74 滴入小鼠 2h，小鼠肺組織中炎癥基因 TNF-α（圖 1A）表達(dá)增加至對照的 2.1 倍（P＜0. 001），該作用延續(xù)至 8 小時，12 小時開始降低，24 小時基本恢復(fù)到對照水平（P＞0.05）。同樣，，sCD74 也能促進(jìn)小鼠肺組織炎癥基因 MIP-2(圖 1B)和 IL-6(圖 1C)高表達(dá)，在 2h 時效果最明顯，分別增高至對照組的 3.4 倍（P＜0. 001）和 2.8 倍（P＜0. 001）。上述實(shí)驗結(jié)果提示，sCD74 氣道滴入早期（2h 至 8h）能夠增加小鼠肺組織中炎癥基因的表達(dá)。

圖 2：不同濃度 sCD74 氣道滴入小鼠肺組織炎癥基因 TNF-（aA）、MIP-2(B)和 IL-6(C)的相對表達(dá)量。（n=3/組，nsP＞0.05，*P＜0.05，***P＜0.001 VS ctrl）sCD74 重組的過程中加入了起穩(wěn)定作用的鼠源性 Ig-Fc 片段，構(gòu)建成融合蛋白。雖然相關(guān)報道表明融合蛋白對目標(biāo)蛋白本身生物學(xué)功能無影響，是蛋白重組的重要實(shí)驗手段。但為了排除融合蛋白中 Ig-Fc 片段對實(shí)驗結(jié)果的影響，我們進(jìn)一步檢測了 Ig-Fc 蛋白是否影響上述炎癥基因的表達(dá)。結(jié)果如圖 3 所示，0.5mg/kg Ig-Fc 蛋白氣道滴入小鼠 2h 與對照相比，上述炎癥基因均無明顯改變（P＞0.05）。上述結(jié)果表明，Ig-Fc 蛋白不能促進(jìn)小鼠肺組織中炎癥基因表達(dá)增加，是 sCD74 促進(jìn)小鼠肺組織炎癥基因表達(dá)增加。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R644;R563.8

【參考文獻(xiàn)】

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1 傅修濤;代智;趙一鳴;周正君;周儉;樊嘉;;肝細(xì)胞癌中CD74的表達(dá)與預(yù)后分析[J];中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志;2012年01期

本文編號：2681107