發(fā)布時間：2020-05-24 06:28

【摘要】：第一部分程序性壞死參與氧化應激誘導髓核細胞死亡的研究目的:研究氧化應激條件下的髓核細胞是否發(fā)生程序性壞死,并探討其可能機制。方法:選取第2代大鼠胸腰段椎間盤髓核細胞,分別用不同濃度H_2O_2處理不同時間,采用cell counting kit-8(CCK-8)評估細胞活性,選擇適宜的濃度和時間用于后續(xù)實驗。通過倒置相差光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化,Annexin V/propidium dide(PI)染色和Hoechst 33258/PI染色分別檢測PI陽性率,透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)變化,RT-PCR及Western Blot檢測RIP1、RIP3的基因及蛋白表達變化。此外,使用Nec-1、基因沉默進一步評估壞死性凋亡對細胞活性及死亡率的影響,免疫組化檢測正常及退變椎間盤中RIP1,RIP3蛋白表達差異。結(jié)果:H_2O_2呈劑量和時間依懶性降低髓核細胞活性。隨著H_2O_2濃度升高,呈現(xiàn)死亡形態(tài)的細胞明顯增多,PI陽性率逐漸升高,細胞超微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)壞死樣改變。RIP1和RIP3基因及蛋白表達均明顯增高。而Nec-1預處理能夠明顯抑制H_2O_2誘導的細胞活性下降、死亡增多、PI陽性率升高及壞死樣超微結(jié)構(gòu)改變。轉(zhuǎn)染SiRNA-RIP3能夠降低H_2O_2誘導的細胞死亡,而SiRNA-RIP1效果則相反。人體標本免疫組化結(jié)果證實,與正常髓核組織相比,退變髓核內(nèi)RIP1、RIP3蛋白表達水平明顯較高。結(jié)論:RIP1/RIP3介導的程序性壞死參與H_2O_2誘導的髓核細胞死亡,而RIP1的作用可能具有兩面性,適度表達則可能促進細胞存活,過度表達促進程序性壞死發(fā)生。調(diào)控程序性壞死有望為降低氧化應激誘導的髓核細胞死亡,進而為椎間盤退行性變的防治提供全新的策略。第二部分氧化應激誘導髓核細胞發(fā)生程序性壞死的機制研究目的:探討RIP1/RIP3介導的髓核細胞程序性壞死與PARP-AIF信號通路相互關系。方法:選取第2代大鼠胸腰段椎間盤髓核細胞,在H_2O_2(250μM)處理24 h后,熒光探針JC-1染色后流式及激光共聚焦檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)變化情況,熒光探針H2DCF-DA染色后流式及激光共聚焦檢測細胞活性氧(ROS)水平改變。Western Blot檢測PARP、PAR、線粒體和細胞核AIF蛋白表達情況,酶標儀檢測PARP酶活性變化,AIF免疫熒光染色后激光共聚焦觀察AIF轉(zhuǎn)位,CCK-8檢測細胞活性,PI染色檢測細胞死亡率。此外,利用RIP1特異性抑制劑Nec-1,PARP特異性抑制劑DPQ,以及基因沉默進一步評估程序性壞死對細胞活性及死亡率的影響。結(jié)果:H_2O_2作用24h后,氧化應激指標ROS明顯升高,線粒體膜電位明顯下降,提示H_2O_2條件下氧化應激水平升高,線粒體功能嚴重受損。而Nec-1明顯抑制H_2O_2誘導的ROS升高,線粒體膜電位下降,表明Nec-1能夠降低H_2O_2誘導的氧化應激水平升高,減輕線粒體功能紊亂。隨著H_2O_2濃度增加,PARP蛋白表達逐漸下降,裂解的PARP(C leaved-PARP)蛋白表達逐漸升高,PARP酶活性及PAR蛋白表達水平明顯升高,線粒體AIF蛋白表達水平逐漸下降,細胞核AIF蛋白表達水平逐漸升高。而Nec-1、SiRNA-RIP3能明顯抑制PARP活性及蛋白表達變化,SiRNA-RIP1則相反。DPQ明顯抑制線粒體AIF下降和細胞核AIF升高,SiRNA-AIF能夠明顯減輕細胞死亡,提高細胞活性。結(jié)論:PARP-AIF途徑作為RIP1/RIP3的下游途徑,在H_2O_2誘導髓核細胞程序性壞死過程中可能發(fā)揮關鍵性作用。調(diào)控氧化應激條件下髓核細胞RIP1/RIP3-PARP-AIF信號通路有望為降低氧化應激誘導的髓核細胞死亡,進而為延緩甚至逆轉(zhuǎn)IVDD提供新的策略與思路。
【圖文】：

33圖 1. Nec-1 對 H2O2導致髓核細胞活性下降的保護作用。（A）：髓核細胞經(jīng)過不同濃度（a, 0 μM; b, 125 μM; c, 250 μM; d, 500 μM）的H2O2處理24 h，顯示出細胞死亡隨H2O2濃度依賴性增加。（B）：在不同濃度（a, 0 μM; b, 125 μM; c, 250 μM; d, 500 μM）H2O2處理24 h之前，，用Nec-1預處理NP細胞，顯示出細胞死亡明顯減少。（比例尺=50 μm）。（C，D）：使用 CCK-8 法測量經(jīng) H2O2處理的髓核細胞的活力。在有或無 Nec-1 預處理的情況下，將髓核細胞置于不同濃度的 H2O2中處理 24 h（C）；將 NP 細胞置于 250μM 的 H2O2不同的時間段（D）：以上數(shù)據(jù)均來自 3 次獨立重復實驗的均值±標準差（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 vs. control）。

34 2. Nec-1 對 H2O2誘導的NP 細胞死亡的影響。（A）：Annexin-V / PI 雙重染色后流胞儀分析細胞死亡率。（B）：流式檢測 PI 陽性率的定量統(tǒng)計分析。PI 陽性率呈濃賴性升高，Nec-1 可有效抑制其升高。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R681.55

【參考文獻】

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1 徐濤濤;廖菲;金紅婷;童培建;肖魯偉;吳承亮;;椎間盤退變與細胞死亡的相關研究進展[J];中國骨傷;2015年07期

2 謝健;童培建;單樂天;吳承亮;;H_2O_2氧化應激誘導兔椎間盤髓核細胞衰老的研究[J];中國骨傷;2013年04期

3 彭寶淦,侯樹勛,施杞,賈連順;The relationship between cartilage end-plate calcification and disc degeneration: an experimental study[J];Chinese Medical Journal;2001年03期

本文編號：2678596