發(fā)布時(shí)間：2020-05-21 12:36

【摘要】：作為一種在骨-軟骨組織內(nèi)廣泛分布的分泌蛋白,Nell-1最早因在顱縫早閉患者的顱骨組織內(nèi)異常高表達(dá)而被發(fā)現(xiàn)。通過大量研究,其對(duì)顱面部骨骼系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用和對(duì)缺損顱骨的修復(fù)作用均已得到證實(shí)。目前用于研究Nell-1功能缺陷的小鼠模型源于N-乙基-N-亞硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea,ENU)誘導(dǎo)所致的Nell-1基因點(diǎn)突變。然而,純合突變小鼠因全身多處骨-軟骨組織的發(fā)育異常而在出生后無法存活,從而使后續(xù)的觀察和研究無法進(jìn)行。因此,本研究運(yùn)用Cre-Lox P重組系統(tǒng),使表達(dá)Col2α1-Cre的軟骨細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的Nell-1缺陷,成功建立條件性Nell-1軟骨特異性敲除小鼠模型(Nell-1Col2α1KO),并在新生階段(出生后0天),青春生長(zhǎng)發(fā)育階段(出生后1個(gè)月)以及成年階段(出生后3個(gè)月)對(duì)其進(jìn)行觀察。結(jié)果表明,WT組與Col2α1-Cre陰性對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,條件性Nell-1軟骨特異性敲除對(duì)雄性小鼠及雌性小鼠產(chǎn)生的影響趨勢(shì)相同,具體如下:新生WT及Nell-1Col2α1KO小鼠的外觀無明顯差異,Alcian Blue-Alizarin Red骨骼染色及體外micro-CT掃描結(jié)果顯示,Nell-1Col2α1KO新生小鼠無骨或軟骨的缺損或缺失,但其股骨長(zhǎng)度略小于WT對(duì)照組。隨著生長(zhǎng)發(fā)育的持續(xù)進(jìn)行,WT與Nell-1Col2α1KO小鼠之間的差異越發(fā)明顯。在出生后1個(gè)月及3個(gè)月時(shí),Nell-1Col2α1KO小鼠表現(xiàn)出了明顯短小的身材,其身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)及體重均顯著降低。與此同時(shí),Nell-1的軟骨特異性敲除也導(dǎo)致小鼠在出生后1個(gè)月時(shí)就表現(xiàn)出了明顯的骨質(zhì)疏松癥狀并穩(wěn)定延續(xù)至成年,具體表現(xiàn)為股骨及脛骨的長(zhǎng)度,骨礦化密度,骨容積,骨小梁數(shù)量,骨小梁厚度,骨小梁間距,皮質(zhì)骨體積,皮質(zhì)骨厚度及皮質(zhì)骨礦化密度的異常。此外,生長(zhǎng)板下方松質(zhì)骨表面成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的數(shù)量及功能也因Nell-1的缺陷而受到影響。通過骨組織形態(tài)計(jì)量分析,我們發(fā)現(xiàn)Nell-1的軟骨特異性敲除使出生后1個(gè)月及3個(gè)月小鼠股骨及脛骨生長(zhǎng)板下方松質(zhì)骨的礦化沉積率及骨表面新骨形成率都顯著降低,從而明確了Nell-1對(duì)松質(zhì)骨形成的重要性。松質(zhì)骨的形成基于軟骨內(nèi)成骨。通過活體micro-CT連續(xù)4周的動(dòng)態(tài)觀察,我們發(fā)現(xiàn)Nell-1Col2α1KO小鼠股骨及脛骨次級(jí)骨化中心處的礦化受到了明顯的抑制。與WT對(duì)照組相比,Nell-1Col2α1KO小鼠次級(jí)骨化中心處的礦化不僅出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)滯后,形成的骨體積也更小,進(jìn)一步表明Nell-1參與對(duì)軟骨內(nèi)成骨過程的調(diào)控。接下來,我們從組織學(xué)層面對(duì)WT及Nell-1Col2α1KO小鼠的生長(zhǎng)板軟骨進(jìn)行觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,條件性Nell-1軟骨特異性敲除降低了出生后期小鼠生長(zhǎng)板內(nèi)軟骨細(xì)胞的增殖水平,并影響其分化及成熟的過程。具體表現(xiàn)為Nell-1Col2α1KO小鼠生長(zhǎng)板軟骨組織內(nèi)降低的Safranin O,Col-2以及Col-10染色;同時(shí),Brd U陽性細(xì)胞數(shù)減少,出生1個(gè)月時(shí)增殖軟骨細(xì)胞層厚度降低。這些體內(nèi)所觀察到的變化均可在體外實(shí)驗(yàn)中通過對(duì)原代WT及Nell-1Col2α1KO軟骨細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)而得到驗(yàn)證:MTT檢測(cè)證實(shí)了Nell-1Col2α1KO軟骨細(xì)胞增殖水平的下降,而Col-2及Aggrecan基因表達(dá)的減少和Alcian Blue染色的減弱都證明了Nell-1Col2α1KO軟骨細(xì)胞分化程度的異常。值得注意的是,這些在體外實(shí)驗(yàn)中因Nell-1缺陷而表現(xiàn)出的不足都可通過對(duì)Nell-1Col2α1KO軟骨細(xì)胞施以人重組Nell-1蛋白(rh NELL-1)而實(shí)現(xiàn)一定程度的補(bǔ)救,從而直接闡明了Nell-1對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、分化、成熟的重要影響,以及在維持生長(zhǎng)板軟骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)過程中的必要性。為了探究Nell-1在出生后期影響小鼠軟骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)并進(jìn)而影響軟骨內(nèi)成骨過程的機(jī)制,我們對(duì)Nell-1以及在這一過程中發(fā)揮重要作用的Ihh-PTHr P信號(hào)通路之間的關(guān)系進(jìn)行探究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,條件性Nell-1軟骨特異性敲除嚴(yán)重影響了Ihh及其受體Patched-1,PTHr P及其受體PTHr P-R的表達(dá)。在Nell-1Col2α1KO小鼠的生長(zhǎng)板內(nèi),通過免疫組織化學(xué)染色,我們可以看到,Ihh、Patched-1、PTHr P以及PTHr P-R的表達(dá)區(qū)域更為局限,表達(dá)水平也明顯降低。與之相應(yīng)的是,在體外實(shí)驗(yàn)中,相比于WT對(duì)照組,Nell-1Col2α1KO軟骨細(xì)胞所呈現(xiàn)出的Ihh-PTHr P信號(hào)通路中的主要因子,即Ihh、Patched-1、Smo、Gli-1以及PTHr P基因表達(dá)水平的顯著下降,同時(shí)伴有Col-2及Aggrecan基因的低表達(dá);此外,Western Blotting結(jié)果也表明在Nell-1Col2α1KO軟骨細(xì)胞中,Ihh、Patched-1、PTHr P以及PTHr P-R的蛋白表達(dá)水平也明顯降低。這些隨Nell-1敲除而產(chǎn)生的基因水平及蛋白水平的表達(dá)降低均可因rh NELL-1的加入而出現(xiàn)回升;但在對(duì)軟骨細(xì)胞加入Ihh信號(hào)通路的抑制劑環(huán)杷明后,rh NELL-1的效果便無法得到發(fā)揮。這表明,Nell-1可通過上調(diào)Ihh-PTHr P信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)對(duì)軟骨細(xì)胞的調(diào)控。更進(jìn)一步,我們對(duì)Nell-1和Gli-1的關(guān)系進(jìn)行了探究。作為Ihh信號(hào)通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子,在正常情況下,Gli-1在信號(hào)通路被激活時(shí),將入核并啟動(dòng)下游基因的表達(dá)。通過研究我們發(fā)現(xiàn),隨著Nell-1的軟骨特異性敲除,Nell-1Col2α1KO軟骨細(xì)胞核內(nèi)Gli-1的蛋白表達(dá)水平發(fā)生了下調(diào);而隨著rh NELL-1的加入,細(xì)胞核內(nèi)Gli-1的蛋白表達(dá)水平又出現(xiàn)上升。這一結(jié)果可通過免疫細(xì)胞染色進(jìn)行觀察,并通過Western Blotting進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí),在Nell-1Col2α1KO軟骨細(xì)胞中,我們還觀察到,Gli-1的下游目的基因Hip-1和N-Myc的表達(dá)水平也出現(xiàn)了顯著下降,雖然加入rh NELL-1可以上調(diào)其表達(dá),但Gli-1的抑制劑GANT61的應(yīng)用使rh NELL-1無法對(duì)Hip-1和N-Myc的基因表達(dá)水平產(chǎn)生影響。通過本研究我們可以看到,條件性Nell-1軟骨特異性敲除將使小鼠出現(xiàn)明顯的肢體短小,并伴有早期發(fā)生的明顯的骨質(zhì)疏松癥狀。而基于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們可以證明,在小鼠出生后,Nell-1可上調(diào)Ihh-PTHr P通路中重要信號(hào)分子的表達(dá),增強(qiáng)軟骨細(xì)胞內(nèi)Gli-1在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)及功能,促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和分化,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)生長(zhǎng)板軟骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維系;并進(jìn)一步通過促進(jìn)軟骨細(xì)胞的成熟,調(diào)控成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的數(shù)量和功能,影響軟骨內(nèi)成骨過程中發(fā)生在次級(jí)骨化中心處的礦化以及生長(zhǎng)板下方松質(zhì)骨的形成。因此,Nell-1對(duì)出生后小鼠的軟骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)及軟骨內(nèi)成骨具有重要的調(diào)控作用。
【圖文】：

圖 2.1 Col2α1-Cre 在軟骨組織內(nèi)的成功表達(dá) （A）whole-mount X-gal 染色：無 Col2α1-Cre表達(dá)的 WT 小鼠未見陽性染色，而有 Col2α1-Cre 表達(dá)的 Nell-1Col2α1-R26RKO 小鼠可見全身多處深藍(lán)色 X-gal 陽性染色。其中，股骨及脛骨的 X-gal 染色僅出現(xiàn)在軟骨端，骨干未見染色；（B）Col2α1-Cre 的特異性持續(xù)表達(dá)：出生 0 天，1 個(gè)月及 3 個(gè)月的脛骨生長(zhǎng)板內(nèi)均可見特異性的 X-gal 陽性染色。

圖 2.1 Col2α1-Cre 在軟骨組織內(nèi)的成功表達(dá) （A）whole-mount X-gal 染色：無 Col2α1-Cre表達(dá)的 WT 小鼠未見陽性染色，而有 Col2α1-Cre 表達(dá)的 Nell-1Col2α1-R26RKO 小鼠可見全身多處深藍(lán)色 X-gal 陽性染色。其中，，股骨及脛骨的 X-gal 染色僅出現(xiàn)在軟骨端，骨干未見染色；（B）Col2α1-Cre 的特異性持續(xù)表達(dá)：出生 0 天，1 個(gè)月及 3 個(gè)月的脛骨生長(zhǎng)板內(nèi)均可見特異性的 X-gal 陽性染色。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R68

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本文編號(hào)：2674308