【摘要】：背景:創(chuàng)傷性腦損傷是神經(jīng)外科最常見的疾病,是主要的致死及致殘因素之一,但是目前臨床上尚沒有公認的診斷TBI的分子標志物,特別是輕度TBI因無明顯影像學(xué)改變,無明顯神經(jīng)系統(tǒng)定位體征,一直是臨床及法醫(yī)學(xué)鑒定的難點。有研究發(fā)現(xiàn)TBI可引起腦組織基因和蛋白質(zhì)表達譜的變化,檢測體液中基因和蛋白質(zhì)的表達變化發(fā)現(xiàn)其中部分與腦組織的損傷程度和臨床預(yù)后密切相關(guān),因而這些損傷前后表達變化差異顯著的基因和蛋白質(zhì)成為TBI潛在的生物標志物。miRNA是一類高度保守的單鏈RNA,血液中90%的miRNA以核酸-蛋白復(fù)合物形式存在,具有高度穩(wěn)定性和抗降解能力,且不隨個體差異、溫度、pH值、時間和酶的存在與否而變化,這些特點使體液miRNA可能成為理想的疾病標記物。蛋白質(zhì)作為生命活動的執(zhí)行者和體現(xiàn)者,隨生命活動的進程表現(xiàn)出緊密而協(xié)調(diào)的變化,在TBI生物標志物的尋找過程中,也有不少研究者將目標聚焦于蛋白質(zhì)。雖然已有不少候選生物標志物被提出,但由于重現(xiàn)性差,僅有少部分對具有影像學(xué)改變的中、重度TBI的診斷和預(yù)后判斷具有參考意義,至今尚未用于臨床診斷,而用于輕度TBI診斷的生物標志物迄今未見報道,同時上述候選生物標志物表達變化與TBI損傷機制及臨床預(yù)后的關(guān)系遠未闡明。本課題組前期應(yīng)用2DE-MALDI-TOF/MS _3研究了大鼠輕度腦損傷后腦組織及血清蛋白質(zhì)表達,確認了15個損傷前后表達差異的蛋白;應(yīng)用生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)擾動等實驗方法,初步證實腦損傷相關(guān)基因水平和蛋白表達水平變化不一致很可能是通過miRNA抑制了基因的轉(zhuǎn)錄。目的:1.應(yīng)用miRNA基因芯片和iTRAQ定量蛋白組學(xué)技術(shù)篩選TBI患者血漿中的生物標志物,并進行驗證及評價,以期尋找TBI臨床診斷客觀指標;2.應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)分析參與TBI后病理進程的生物過程及信號通路,為闡明其發(fā)病機理、尋找其治療靶點提供理論基礎(chǔ)。方法:1.樣本收集:按照標準收集輕度、中度、重度TBI患者以及健康對照人員血漿各30例;2.miRNA芯片:選取每組5例樣本應(yīng)用miRNA芯片進行檢測,分析數(shù)據(jù),比較不同損傷程度TBI患者血漿樣本差異miRNA表達譜,應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)對差異miRNA的靶基因進行富集分析,篩選潛在的診斷分子標志物,然后應(yīng)用RT-qPCR對這些miRNAs進行擴大樣本驗證,ROC曲線分析各miRNA診斷TBI的特異性和靈敏度;3.iTRAQ定量蛋白組學(xué)分析:將血漿樣本酶解后應(yīng)用iTRAQ試劑進行標記,經(jīng)分離后行質(zhì)譜檢測,然后對所得數(shù)據(jù)進行信息學(xué)分析,比較各組差異蛋白表達,并應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)對差異蛋白進行富集分析,應(yīng)用ELISA對選取的差異蛋白及其上下游關(guān)鍵蛋白進行驗證,ROC曲線分析各蛋白診斷TBI的特異性和靈敏度。結(jié)果:1.受試者臨床特征:共有90名符合條件的TBI患者及30名健康志愿者納入研究。輕、中、重度TBI組及對照組各5例樣本進行miRNA芯片和iTRAQ檢測,輕_4、中、重度TBI組患者從受傷至采血時間分別為7.54±2.81h,6.08±0.79 h,6.16±1.19 h,各組間無統(tǒng)計學(xué)差異。輕、中、重度TBI組及對照組各25例進行后續(xù)驗證實驗,輕、中、重度TBI組患者從受傷至采血時間分別為7.22±1.75 h,7.16±1.57 h,6.53±1.56 h,各組間無統(tǒng)計學(xué)差異。2.miRNA芯片結(jié)果及驗證:(1)與對照組相比,輕、中、重度TBI組患者血漿分別有65,33和16個miRNAs表達上調(diào),29,27和6個miRNAs表達下調(diào)。其中三組損傷組都有顯著改變的有13個miRNAs(其中7個上調(diào),6個下調(diào))。(2)miRNA靶基因GO富集分析結(jié)果顯示,輕度及中度TBI患者組出現(xiàn)10個共同的生物過程,而只有血管加壓素對全身動脈血壓的調(diào)節(jié)這一生物過程在輕、中、重度TBI組均出現(xiàn)。這些結(jié)果證明輕度及中度TBI可能具有相近的病理進程。(3)Pathway富集分析結(jié)果顯示,幾條重要的通路均參與輕、中、重度TBI的損傷進程,包括:p53信號通路、mTOR信號通路、TGF-beta信號通路、泡囊運輸中的誘捕相互作用、煙酸和煙酰胺代謝、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路。此外,兩種神經(jīng)生物學(xué)通路:泛酸鹽和CoA生物合成,長時程抑制則只出現(xiàn)在輕度TBI組的前15個通路中。(4)我們選擇芯片結(jié)果中與正常組血漿相比各損傷組患者血漿中均表達上調(diào)的miRNAs(miR-6867-5p,miR-3665,miR-328-5p,miR-762,miR-3195,miR-4669and miR-2861)進行qRT-PCR驗證。qRT-PCR驗證結(jié)果與芯片結(jié)果一致:與對照組相比,輕、中、重度TBI組患者血漿中7種miRNAs均顯著增高,重度TBI組中miR-3195,miR-328-5p表達水平比輕、中度TBI組顯著增高,重、中度TBI組中m_5iR-6867-5p表達水平比輕度TBI組顯著增高。(5)采用ROC曲線方法來計算ROC曲線下的面積,以評估這七個miRNAs診斷TBI的準確性。各miRNA的AUC值分別為:miR-6867-5p(0.854,P0.001),miR-3665(0.877,P0.001),miR-328-5p(0.888,P0.001),miR-762(0.916,P0.001),miR-3195(0.899,P0.001),miR-4669(0.907,P0.001),and miR-2861(0.913,P0.001)。所有miRNAs都顯示出良好的診斷準確性。(6)ROC分析這些miRNAs是否可以用于診斷輕度TBI(mTBI)。AUC值如下:miR-6867-5p(0.765,P0.001),miR-3665(0.916,P0.001),miR-328-5p(0.855,P0.001),miR-762(0.921,P0.001),miR-3195(0.859,P0.001),miR-4669(0.894,P0.001),and miR-2861(0.898,P0.001),所有這些miRNAs在鑒別輕度TBI患者時都具有一定的診斷準確率,其中miRNA-3665和miR-762在診斷輕度TBI患者時具有較好的診斷準確率。3.iTRAQ結(jié)果及驗證:(1)iTRAQ定量實驗共鑒定到5035條肽段和1109個蛋白。與健康對照組相比,輕度、中度和重度TBI組表達上調(diào)的蛋白數(shù)分別為90、92和103,表達下調(diào)的蛋白數(shù)分別為42、58和58。(2)差異蛋白的GO富集分析結(jié)果顯示,TBI損傷后差異蛋白更多與急性期反應(yīng),急性炎癥反應(yīng),損傷反應(yīng),應(yīng)激反應(yīng),血小板活化,損傷修復(fù),凝血等生物進程相關(guān)。其中輕度TBI和中度TBI組富集結(jié)果更加接近,而重度TBI的生物進程中脂質(zhì)代謝相關(guān)的生物進程如甘油三酯分解代謝過程的調(diào)控,脂質(zhì)分解過程的調(diào)節(jié),甘油三酯代謝過程的調(diào)控,甘油三酯代謝過程的正向調(diào)節(jié),排名相對比較靠前。(3)pathway富集分析結(jié)果顯示,三組_6 TBI均涉及到的信號通路有Hippo信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,補體與凝血級聯(lián)反應(yīng)和沙門氏菌感染。(4)ELISA驗證補體級聯(lián)反應(yīng)中Classical pathway和Lectin pathway中的關(guān)鍵蛋白分子C4、C4b、C3、C3b、C4BP、C5,結(jié)果顯示TBI后各損傷組C4、C4b表達水平均出現(xiàn)顯著上調(diào)(P0.05),且C4表達水平在輕、中、重度TBI組之間比較存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。C3和C3b各組表達無明顯差異。C4BP作為該級聯(lián)通路的抑制性因子,三組不同損傷程度TBI組較正常對照組均出現(xiàn)顯著下調(diào)(P0.05)。同樣,C5表達水平在不同程度TBI組中均表達上調(diào),且重度TBI組表達高于輕度TBI組(P0.05)。(5)采用ROC曲線分析評估C4,C4b和C5診斷TBI的準確性。ROC曲線下面積AUC值分別為:C4(0.882,P0.001),C4b(0.910,P0.001),C5(0.924,P0.001)。(6)ROC分析C4,C4b和C5診斷輕度TBI的準確性,AUC值如下:C4(0.779,P0.001),C4b(0.893,P0.001),C5(0.874,P0.001),C4b和C5在鑒定輕度TBI患者診斷準確率較高。結(jié)論:1.TBI患者血漿中miR-6867-5p,miR-3665,miR-328-5p,miR-762,miR-3195,miR-4669 and miR-2861可以作為TBI的診斷標志物。miR-3195和miR-328-5p兩種miRNAs可用于鑒別診斷輕、中度TBI和重度TBI。2.miRNA靶基因GO富集分析結(jié)果顯示,輕度及中度TBI患者組出現(xiàn)10個共同的生物過程,而只有血管加壓素對全身動脈血壓的調(diào)節(jié)這一生物過程在輕、中、重度TBI組均出現(xiàn)。3.miRNA Pathway富集分析結(jié)果顯示,幾條重要的通路均參與輕、中、重TBI的損傷進程,包括:p5_73信號通路、mTOR信號通路等。4.差異蛋白的GO富集分析結(jié)果顯示,TBI損傷后差異蛋白更多與急性期反應(yīng),急性炎癥反應(yīng),損傷反應(yīng),應(yīng)激反應(yīng),血小板活化,損傷修復(fù),凝血等生物進程相關(guān)。5.差異蛋白的pathway富集分析結(jié)果顯示,三組TBI均涉及到的信號通路有Hippo信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,補體與凝血級聯(lián)反應(yīng)和沙門氏菌感染。6.通過差異miRNA和蛋白富集分析結(jié)果顯示,輕度TBI與中度TBI的病理過程更為接近,重度TBI則相對獨立。7.補體與凝血級聯(lián)反應(yīng)通路在TBI中活化,重度TBI組的關(guān)鍵蛋白C4,C4b和C5表達明顯高于輕度和中度TBI組,提示其在重度TBI時活化程度更高。C4,C4b和C5可作為TBI的潛在診斷標志物,其中C4b和C5在鑒別輕度TBI時診斷準確率較高。
【圖文】：

圖 1-1 散點圖(輕度 TBI 組 VS 正常對照組)Fig. 1-1 ScatterPlot(mild TBI group VS control group)

圖 1-2 散點圖(中度 TBI 組 VS 正常對照組)Fig. 1-2 ScatterPlot(moderate TBI group VS control group)
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R651.15

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 齊斌;余麗梅;;microRNA概述及其研究進展[J];組織工程與重建外科雜志;2014年06期

2 劉丹丹;赫曉燕;;MicroRNA對動物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)作用[J];畜禽業(yè);2009年10期

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本文編號：2672354