【摘要】：目的:1、探討骨形成肽-1(BFP-1)對(duì)兔外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)增殖、遷移和成血管功能的影響及可能的分子機(jī)制。2、研究β-磷酸三鈣支架(β-TCP)負(fù)載BFP-1的體外釋放規(guī)律,觀察EPCs在負(fù)載BFP-1的β-TCP支架上的活性和增殖情況。3、探討負(fù)載BFP-1的β-TCP支架復(fù)合自體EPCs構(gòu)建的血管化組織工程骨β-TCP/BFP-1/EPCs用于修復(fù)兔股骨干節(jié)段性骨缺損的血管生成和骨生成的效果。方法:1、應(yīng)用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)兔外周血EPCs,并對(duì)EPCs進(jìn)行表型和功能的鑒定。選用第三代EPCs,用不同濃度的BFP-1(100,200,300μg/ml)干預(yù)EPCs 1至7天,使用CCK8比較細(xì)胞的增殖情況;應(yīng)用Transwell檢測(cè)不同濃度的BFP-1對(duì)EPCs遷移能力的影響;檢測(cè)不同濃度的BFP-1對(duì)EPCs在Matrigel上形成血管樣結(jié)構(gòu)的影響。2、使用不同濃度的BFP-1處理EPCs 1天和3天后,采用熒光定量PCR檢測(cè)成血管相關(guān)基因VEGF、VEGFR2、e NOS和ALK-1的表達(dá);通過(guò)western blot檢測(cè)不同濃度的BFP-1作用于EPCs 1天后Smad 1/5蛋白的表達(dá)。3、采用冷凍干燥法將BFP-1負(fù)載至β-TCP支架上制作β-TCP/BFP-1支架復(fù)合體,應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)BFP-1自β-TCP支架上的釋放性能;將EPCs接種于β-TCP/BFP-1支架復(fù)合體上,體外培養(yǎng)1至10天,使用共聚焦顯微鏡觀察EPCs在支架復(fù)合體上的活性和增殖情況。4、采用負(fù)載BFP-1的β-TCP支架與自體外周血EPCs復(fù)合構(gòu)建血管化的組織工程骨(β-TCP/BFP-1/EPCs),并構(gòu)建組織工程骨β-TCP/EPCs、β-TCP/BFP-1和β-TCP,比較研究其對(duì)新西蘭大白兔股骨干節(jié)段性骨缺損的修復(fù)效果。5、術(shù)后4周和12周對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行Microfil血管造影、Micro-CT血管掃描和組織學(xué)免疫組化染色,評(píng)估組織工程骨內(nèi)的血管生成情況。6、術(shù)后4周和12周對(duì)各組兔子進(jìn)行X線片、Micro-CT骨掃描和組織學(xué)切片檢查,評(píng)估組織工程骨內(nèi)的骨生成情況,并于術(shù)后12周時(shí)進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)評(píng)估骨修復(fù)的力學(xué)效果。結(jié)果:1、兔外周分離出的EPCs能夠形成“鋪路石”樣排列,細(xì)胞表面分子標(biāo)記VEGFR2和v WF熒光染色陽(yáng)性,EPCs可攝取Dil-Ac-LDL且能與FITC-UEA-1結(jié)合。2、不同濃度的BFP-1均對(duì)EPCs的增殖無(wú)不良影響。BFP-1可促進(jìn)EPCs的遷移和形成血管樣結(jié)構(gòu),上調(diào)EPCs基因VEGF、VEGFR2、e NOS和Alk-1的表達(dá),并使其Smad1/5蛋白磷酸化的水平升高,以200μg/ml的濃度效應(yīng)最為顯著。3、β-TCP支架能夠吸附BFP-1,其結(jié)合的BFP-1在經(jīng)歷短期的突釋后能夠緩慢穩(wěn)定釋放長(zhǎng)達(dá)28天。β-TCP支架具有較好的細(xì)胞相容性,EPCs可以在β-TCP支架上正常的生長(zhǎng)和增殖。EPCs在構(gòu)建的β-TCP/BFP-1復(fù)合體上可以正常生長(zhǎng),細(xì)胞能夠保持較高的增殖活性。4、Micro-CT血管掃描顯示構(gòu)建的β-TCP/BFP-1/EPCs組織工程骨在術(shù)后4周和12周的血管體積分?jǐn)?shù)和血管面積值均顯著高于β-TCP/EPCs組、β-TCP/BFP-1組和β-TCP組。CD34免疫組化分析顯示β-TCP/BFP-1/EPCs組在術(shù)后4周和12周的新生血管密度均較β-TCP/EPCs組、β-TCP/BFP-1組和β-TCP組的高。5、術(shù)后12周的X線片評(píng)分和Micro-CT骨掃描分析結(jié)果顯示構(gòu)建的β-TCP/BFP-1/EPCs組的新生骨量明顯高于β-TCP/EPCs組、β-TCP/BFP-1組和β-TCP組。HE染色示在植入4周和12周后β-TCP/BFP-1/EPCs組的骨移植物與斷端自體骨交界區(qū)的整合最為致密。4周和12周時(shí)硬組織切片Van-Gieson染色見(jiàn)β-TCP/BFP-1/EPCs組的新骨生成面積顯著高于β-TCP組、β-TCP/BFP-1組和β-TCP/EPCs組,同時(shí)β-TCP/BFP-1/EPCs組支架的降解量明顯多于β-TCP/EPCs組、β-TCP/BFP-1組和β-TCP組。生物力學(xué)結(jié)果示β-TCP/BFP-1/EPCs組的最大載荷和最大彎曲應(yīng)力顯著高于與β-TCP/BFP-1組、β-TCP/EPCs組和β-TCP組。結(jié)論:1、應(yīng)用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法可獲得高純度、足量的內(nèi)皮祖細(xì)胞。2、BFP-1具有促EPCs成血管的作用,且BFP-1通過(guò)ALK-1/Smad信號(hào)通路介導(dǎo)其促EPCs成血管的效能。3、β-TCP支架能夠相對(duì)緩釋BFP-1,負(fù)載BFP-1的β-TCP支架具有較好的細(xì)胞相容性并能支持EPCs的增殖。4、構(gòu)建的β-TCP/BFP-1/EPCs血管化組織工程骨具有較好的組織相容性,在體內(nèi)有較強(qiáng)的促血管生成效應(yīng),同時(shí)有較好的成骨效能,修復(fù)負(fù)重區(qū)大段骨缺損的效果可靠,這種復(fù)合構(gòu)建血管化組織工程骨的方式簡(jiǎn)單、有效,具有較好的臨床應(yīng)用前景。
【圖文】：

細(xì)胞呈向梭形轉(zhuǎn)變（圖1-1A）。接種至第 5 天，細(xì)胞出現(xiàn)加速生長(zhǎng)，，梭形細(xì)胞呈放射狀排布（圖 1-1B）。之后，細(xì)胞增殖進(jìn)一步加快，第 10 天時(shí)細(xì)胞形態(tài)漸趨均一，局部出現(xiàn)“鋪路石”樣排列（圖 1-1C）。圖 1-1，EPCs 在光鏡下的形態(tài)觀察Figure 1-1, Morphology of EPCs observed under microscope. The cells showedtypical cobblestone-like appearance after 10 days. Scale bar = 100 μm

19表面標(biāo)記 VEGFR2 的熒光鑒定unophenotype of EPCs showed the expression ofr fluorescent microscope. Scale bar = 100 μm.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R681.8

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6 王

本文編號(hào)：2671535