【摘要】：目的脊髓缺血再灌注損傷是心血管外科手術后發(fā)生率較高、較為嚴重的并發(fā)癥之一,目前的預防和治療手段有限,尋找新的方法勢在必行。自噬是新近研究的熱點,它在細胞代謝及組織損傷修復等病理生理過程中發(fā)揮重要作用。microRNAs是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類非編碼單鏈的RNA分子,不僅與多種疾病的發(fā)生密切相關并且還參與調控包括自噬在內的諸多病理生理過程。microRNA-204在脊髓缺血再灌注損傷早期就有明顯表達而且與自噬關系密切,而脊髓損傷早期是神經(jīng)元細胞修復治療的黃金時期,故本實驗以microRNA-204作為分子靶點,觀察在大鼠脊髓缺血再灌注損傷早期,抑制microRNA-204的表達后對大鼠后肢運動神經(jīng)功能的影響,著力從自噬與凋亡方面研究其相關的分子機制,旨在探索脊髓神經(jīng)保護的新策略。研究方法隨機選取體重250g左右的雄性SD大鼠50只,分為假手術組、缺血再灌注6小時、12小時、24小時及48小時組(n=10),除假手術組外,其他各組均采用開胸阻斷左鎖骨下動脈遠端胸降主動脈14min的方法建立大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型,分別于再灌注6小時、12小時、24小時,48小時對各組大鼠進行運動神經(jīng)功能進行評分(MDI運動功能評分法),評分后取脊髓標本分別進行:HE染色,觀察再灌注后不同時間點大鼠脊髓組織病理學變化;電鏡下觀察脊髓損傷后神經(jīng)元細胞自噬的發(fā)生及自噬體的形態(tài);免疫組化檢測自噬特異性蛋白LC3II的表達;western-blot檢測自噬特異性蛋白LC3、Beclin 1及microRNA-204的靶蛋白bcl-2的表達;qRT-PCR檢測大鼠microRNA-204的表達。另取雄性SD大鼠60只,隨機分為6組。假手術組(sham組):開胸不阻斷胸降主動脈;對照組(control組):開胸阻斷胸降主動脈14 min;空白對照病毒載體組(vector組):鞘內注射10μl空白慢病毒載體(1×10~7TU),5天后開胸阻斷胸降主動脈14 min;抑制microRNA-204組(antagomiRNA-204組):利用H1-MCS-CMV-EGFP構建lentivirally expressed antagomiRNA-204載體,鞘內注射10μl含有antagomiRNA-204的慢病毒載體(1×10~7TU)進行大鼠脊髓基因轉染,抑制大鼠脊髓microRNA-204的表達,5天后開胸阻斷胸降主動脈14 min;抑制自噬組(3-MA組):鞘內注射自噬抑制劑3-MA(100μg溶于2μl生理鹽水)后阻斷主動脈14min;抑制microRNA-204+抑制自噬組(antagomiRNA-204+3-MA組):鞘內注射10μlantagomiRNA-204,濃度1×107TU/ml,5天后處理同3-MA組。于再灌注6、12、24、48小時分別對6組動物進行后肢運動功能評分(MDI),于48小時后處死動物,取腰4-6節(jié)段脊髓組織進行HE染色并計數(shù)健存神經(jīng)元數(shù),TUNEL染色并計數(shù)凋亡細胞,western blot檢測凋亡蛋白caspase-3的表達的改變。另取6組動物(n=4)進行平行實驗,于再灌注6小時處死動物取腰4-6節(jié)段脊髓組織,qRT-PCR檢測microRNA-204的表達,western blot檢測bcl-2、Beclin-1、LC3-II蛋白的表達。結果1、大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型效果確切。在脊髓缺血再灌注損傷模型中,缺血再灌注后6、12、24、48小時4個時間點各組的運動神經(jīng)功能評分較假手術組明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),同時HE染色下可見不同程度神經(jīng)元細胞腫脹、壞死,尼氏體結構模糊不清等改變,與神經(jīng)功能改變的病理學變化特征相一致。2、脊髓缺血再灌注損傷后激活自噬。透射電鏡下可見脊髓前角運動神經(jīng)元胞漿廣泛水腫,線粒體腫脹,空泡化,粗面內質網(wǎng)松散、空泡的形成和雙層膜包裹細胞器碎片的自噬體;免疫組化下自噬特異性蛋白LC3II的表達明顯增加。Western-blot的結果顯示:與假手術組相比較,LC3-II/LC3-I的比率表達于再灌注12小時增加顯著(P0.05),24小時達到高峰(P0.05),48小時后回落,6h組與48h組LC3-II/LC3-I的比率與假手術組比較,無明顯統(tǒng)計學差異(P=0.206 and 0.854,P0.05)。自噬調節(jié)蛋白Beclin 1的表達與假手術組相比較,于再灌注6、12、24、48小時四個時間點的表達雖然有增加,但無明顯統(tǒng)計學差異(P值分別等于1.000,0.952,1.000及1.000,P0.05)。3、大鼠脊髓缺血再灌注損傷早期,microRNA-204的表達明顯上調,其靶蛋白bcl-2的表達下調。與sham組相比較,microRNA-204的表達在6、12、24小時明顯上調(P0.05),48小時后回落至假手術組水平(P0.05);靶蛋白bcl-2的表達與sham組相比在6、12、24小時明顯下調(P0.05),48小時后回升至假手術組水平(P0.05),二者負相關性。4、鞘內注射antagomiRNA-204慢病毒顯著抑制microRNA-204的表達。與control組相比較,在缺血再灌注后的6小時antagomiRNA-204組及antagomiRNA-204+3-MA組的microRNA-204的表達明顯減少(P0.05),而vector組及3-MA組的microRNA-204的表達與control組相比較,均無明顯統(tǒng)計學差異(allP0.05),說明本實驗鞘內注射antagomiRNA-204慢病毒能顯著抑制microRNA-204的表達,該作用與3-MA及慢病毒載體無關。5、鞘內注射antagomiRNA-204慢病毒顯著改善大鼠后肢的運動神經(jīng)功能,而鞘內注射3-MA則削弱了這個作用,該作用與病毒載體無關。與control組相比較,vector組MDI評分于再灌注后的6、12、24、48小時4個時間點均無顯著差異(P0.05)。與control組相比較,antagomiRNA-204組的MDI評分在4個時間點均顯著降低(P0.003),大鼠的后肢運動功能明顯增強,而鞘內注射自噬阻斷劑3-MA后則削弱了antagomiRNA-204的神經(jīng)保護作用,即在缺血再灌注損傷后的的4個時間點,antagomiRNA-204+3-MA組大鼠的后肢運動功能明顯減弱,與control組相比較,MDI評分沒有明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。antagomiRNA-204+3-MA組的MDI評分于再灌注12、24小時較antagomiRNA-204組明顯增加(p0.05)。6、鞘內注射antagomiRNA-204慢病毒后,健存的神經(jīng)元細胞數(shù)明顯增加,凋亡細胞數(shù)明顯減少。HE染色下antagomiRNA-204組脊髓組織結構比較完整,神經(jīng)元細胞體呈多角型,胞體結構清晰,胞漿豐富,健存正常運動神經(jīng)元數(shù)明顯增加(vs control group,P0.05);而antagomiRNA-204+3-MA組的神經(jīng)元細胞結構不清,核濃染,空泡增多,細胞間距增加,排列紊亂,健存神經(jīng)元數(shù)目較antagomiRNA-204組顯著降低(P0.05),與對照組相比較,無明顯差異(vs control group,P0.05)。TUNEL染色下脊髓前角的凋亡神經(jīng)元細胞計數(shù)顯示,鞘內注射antagomiRNA-204后,即antagomiRNA-204組的凋亡細胞數(shù)較對照組明顯減少(P0.05);而給予3-MA干預后的antagomiRNA-204+3-MA組,其脊髓組織中TUNEL染色陽性細胞數(shù)目明顯增多(vs antagomiRNA-204 group,P0.05),與對照組相比較無明顯差異(vs control group,P0.05)。7、鞘內注射antagomiRNA-204慢病毒載體后,大鼠自噬特異性蛋白LC3-II/LC3-I的比率及Beclin 1的表達于再灌注后6小時就顯著上調,而3-MA則逆轉了這種上調作用。與control組相比較,antagomiRNA-204組的自噬特異性蛋白LC3-II/LC3-I的比率及Beclin 1蛋白的表達顯著增加(all P0.05),然而繼而鞘內注射自噬阻滯劑3-MA后的antagomiRNA-204+3-MA組與antagomiRNA-204組相比較,LC3-II/LC3-I比率及Beclin 1蛋白的表達明顯下降(P0.05)。8、鞘內注射antagomiRNA-204慢病毒載體明顯上調抗凋亡蛋白bcl-2蛋白的表達,3-MA對該上調作用無明顯影響。與control組相比較,antagomiRNA-204組于缺血再灌注6小時就明顯增加其靶蛋白bcl-2的表達,差別有統(tǒng)計學意義,(P0.05);antagomiRNA-204+3-MA組的bcl-2的表達與antagomiRNA-204組相比較無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。9、鞘內注射antagomiRNA-204在脊髓缺血再灌注損傷早期抑制凋亡相關蛋白caspase-3蛋白的表達,該作用與3-MA無明顯相關。脊髓缺血再灌注損傷48小時,與sham group相比較,control組及vector組的凋亡相關蛋白caspase-3的表達明顯增加(P0.05)。與control group相比較,鞘內注射antagomiRNA-204組的caspase-3的表達明顯降低,(P0.05);3-MA組的caspase-3的表達沒有顯著差異(P0.05)。與antagomiRNA-204組相比較,antagomiRNA-204+3-MA組caspase-3的表達沒有統(tǒng)計學差異(P0.05)。結論抑制microRNA-204表達,在大鼠脊髓缺血再灌注損傷早期,對大鼠脊髓神經(jīng)元有保護作用,其原因主要與促進自噬,抑制凋亡有關。
【圖文】：

圖 3.1 各組大鼠后肢運動功能MDI評分(n=10)（sham組：假手術組；6h組：缺血再灌注 6 小時：12h組：缺血再灌注 12 小時：24h組：缺血再灌注 24 小時：48h組：缺血再灌注 48 小時：*vs sham group，P<0.05）3.3 各組大鼠脊髓組織病理學檢測結果sham 組(a)脊髓組織結構清晰，可見尼氏體，神經(jīng)元細胞胞體大小正常，呈多角形，染色均勻，核仁明顯。缺血 6h(b）、12h（c）、24h（d）、48h（e）各組神經(jīng)元細胞結構不清，大小形狀各異，正常多極形運動神經(jīng)元細胞明顯減少，細胞腫脹，極性變鈍，細胞排列紊亂，細胞間隙變寬，可見出血點，紅細胞外逸，，核顯示不清，部分細胞變性、壞死，大量空泡形成，核固縮，濃染，見圖 3.2。

圖 3.2 各組大鼠脊髓HE染色病理組織學變化（圖a:假手術組；圖b：缺血再灌注 6 小時；圖c：缺血再灌注 12 小時；圖d：缺血再灌注 24小時；圖e：缺血再灌注 48 小時；）3.4 透射電鏡及免疫組化檢測大鼠脊髓組織自噬特異性蛋白LC3II的表達假手術組(A圖）:脊髓組織結構緊致，前角運動神經(jīng)元胞體結構清楚，大小正常，核質均勻核仁可見，內質網(wǎng)無腫脹，核糖體游離較少，線粒體呈球狀或半環(huán)狀，線粒體內膜向內皺褶形成線粒體嵴（如圖C）。缺血再灌注 24 小時組（B 圖）脊髓組織結構松散，前角運動神經(jīng)元胞體膨大，內部結構模糊，胞體水腫，胞質邊集，核質染色不均，核仁模糊或裂解，粗面內質網(wǎng)腫脹，游離核糖體增多。細胞中出現(xiàn)許多由單、雙層膜組成的囊泡狀結構(自
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R614

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 胡嘉瑞;呂國華;李晶;王冰;鄧幼文;康意軍;;阿托伐他汀預處理對脊髓缺血再灌注損傷大鼠損傷脊髓microRNA表達的影響[J];中國脊柱脊髓雜志;2014年09期

2 李文潔;楊拯;;Caspase-3與脊髓損傷的相關治療[J];中國康復醫(yī)學雜志;2010年10期

3 盧e

本文編號：2669756