【摘要】：目的:研究腫瘤壞死因子α(TNF-α)在壞死股骨頭內(nèi)的表達水平以及TNF-α對SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響。方法:1.從手術(shù)中獲取股骨頭壞死患者的股骨頭,采用酶聯(lián)免疫夾心法(ELISA法)測定股骨頭內(nèi)正常骨、硬化骨及壞死骨內(nèi)TNF-α的含量,并分析三種骨內(nèi)TNF-α含量的差異,及硬化骨內(nèi)含量變化與患者年齡、性別、病因、證型、疼痛時間、ARCO分期和JIC分型之間的相關(guān)性。2.提取SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,體外常規(guī)培養(yǎng)、傳代至第4代進行實驗。在不同濃度TNF-α干預下,成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的第14天、第21天分別進行ALP染色、ALP活性測定、茜素紅染色和鈣鹽沉積定量測定,觀察不同濃度TNF-α對SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響,根據(jù)染色結(jié)果,確定作用最明顯的TNF-α濃度,并在此濃度干預骨髓間充質(zhì)干細胞的第5天提取細胞RNA和蛋白,分別進行實時熒光定量PCR和Western-blot實驗,分析TNF-α對成骨分化相關(guān)基因和蛋白的影響;干預的第5天提取基因組DNA,分析干預前后Runx2啟動子區(qū)CpG島DNA甲基化水平的變化;在干預的第5天,進行染色質(zhì)免疫共沉淀實驗,分析組蛋白H3K4和H3K27甲基化水平的變化。結(jié)果:1.共獲取60例股骨頭壞死患者的股骨頭,男性45例,女性15例,平均年齡48.88±12.98歲;60例患者正常骨TNF-α含量90.66±40.29pg/ml,硬化骨TNF-α含量122.61±45.84pg/ml,壞死骨TNF-α含量65.79±34.79pg/ml;45例男性患者正常骨TNF-α含量88.74±36.89pg/ml,硬化骨TNF-α含量128.02±46.67pg/ml,壞死骨TNF-α含量65.91±35.55pg/ml,15例女性正常骨TNF-α含量96.42±50.16pg/ml,硬化骨TNF-α含量106.39±40.48pg/ml,壞死骨TNF-α含量65.43±39.53pg/ml;年齡段18-35歲14例,壞死骨TNF-α含量90.87±39.54pg/ml,硬化骨TNF-α含量104.93±35.11pg/ml,壞死骨TNF-α含量61.27±35.39pg/ml,年齡段36-50歲18例,正常骨TNF-α含量88.65±34.29pg/ml,硬化骨TNF-α含量126.44±31.03pg/ml,壞死骨TNF-α含量69.67±28.99pg/ml,年齡段50歲28例,正常骨TNF-α含量91.84±45.27pg/ml,硬化骨TNF-α含量128.99±56.38pg/ml,壞死骨TNF-α含量65.55±38.62pg/ml;特發(fā)性壞死、肝腎虧虛型8例,正常骨TNF-α含量99.18±40.45pg/ml,硬化骨TNF-α含量130.87±43.29pg/ml,壞死骨TNF-α含量77.00±31.13pg/ml,激素性壞死、腎虛血瘀型18例,正常骨TNF-α含量93.10±42.68pg/ml,硬化骨TNF-α含量129.34±54.82pg/ml,壞死骨TNF-α含量70.19±37.37pg/ml,酒精性壞死、痰瘀蘊結(jié)型29例,正常骨TNF-α含量88.87±39.02pg/ml,硬化骨TNF-α含量121.82±41.51pg/ml,壞死骨TNF-α含量64.73±35.11pg/ml,創(chuàng)傷性壞死、氣滯血瘀型5例,正常骨TNF-α含量78.62±47.92pg/ml,硬化骨TNF-α含量89.74±34.47pg/ml,壞死骨TNF-α含量38.19±17.11pg/ml;疼痛時間0-12個月33例,正常骨TNF-α含量91.24±42.93pg/ml,壞死骨TNF-α含量124.87±51.05pg/ml,硬化骨TNF-α含量67.92±37.73pg/ml,疼痛時間13-24個月11例,正常骨TNF-α含量105.19±37.57pg/ml,硬化骨TNF-α含量115.21±45.55 pg/ml,壞死骨TNF-α含量68.76±34.44pg/ml,疼痛時間24個月16例,正常骨TNF-α含量79.48±34.96pg/ml,硬化骨TNF-α含量123.05±35.66pg/ml,壞死骨TNF-α含量59.35±29.53pg/ml;ARCOIIIA期6例,正常骨TNF-α含量95.36±34.22 pg/ml,49.77±20.50pg/ml,73.81±31.09pg/ml,ARCOIIIB 31例,正常骨TNF-α含量92.27±43.04pg/ml,硬化骨TNF-α含量128.79±50.32pg/ml,壞死骨TNF-α含量68.84±37.87pg/ml,ARCOIIIC 9例,正常骨TNF-α含量104.11±43.99pg/ml,硬化骨TNF-α含量117.43±45.69pg/ml,壞死骨TNF-α含量69.99±38.82pg/ml,ARCOIV 14例,正常骨TNF-α含量76.42±32.99pg/ml,硬化骨TNF-α含量100.62±35.74pg/ml,壞死骨TNF-α含量52.89±25.32pg/ml;JIC C1型35例,正常骨TNF-α含量96.96±42.00pg/ml,硬化骨TNF-α含量126.16±47.94pg/ml,壞死骨TNF-α含量71.14±36.35pg/ml,JIC C2型25例,正常骨TNF-α含量81.82±36.76pg/ml,硬化骨TNF-α含量117.64±43.21pg/ml,壞死骨TNF-α含量58.29±31.67pg/ml。通過單因素方差分析,正常骨、硬化骨和壞死骨TNF-α含量與患者性別、年齡(18-35歲、36-50歲、50歲)、病因(特發(fā)性、激素性、酒精性、創(chuàng)傷性)、證型(肝腎虧虛、腎虛血瘀、痰瘀蘊結(jié)、氣滯血瘀)、疼痛時間(0-12月、13-24月、24月)、ARCO分期(IIIA、IIIB、IIIC、IV)、JIC分型(C1、C2)均無相關(guān)性(P0.05);通過多個因素的二分類Logistic回歸分析,壞死股骨頭內(nèi)硬化骨TNF-α含量與患者性別、年齡(18-35歲、36-50歲、50歲)、病因(特發(fā)性、激素性、酒精性、創(chuàng)傷性)、證型(肝腎虧虛、腎虛血瘀、痰瘀蘊結(jié)、氣滯血瘀)、疼痛時間(0-12月、13-24月、24月)、JIC分型(C1、C2)均無相關(guān)性(P0.05),而與ARCO分期(IIIA、IIIB、IIIC、IV)有相關(guān)性(P=0.0490.05),優(yōu)勢比為0.381,即股骨頭壞死ARCO分期每增加一期,股骨內(nèi)硬化骨TNF-α含量就會增加0.381倍。2.提取的SD大鼠干細胞形態(tài)呈長梭形,具有多向分化潛能,能夠向成骨細胞、成軟骨細胞和成脂肪細胞分化,明確提取的是SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞;不同濃度TNF-α(10pg/ml、100pg/ml、1000pg/ml和10000pg/ml)不會影響干細胞的活性;ALP染色和茜素紅染色結(jié)果顯示,10pg/ml和100pg/ml對SD骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化無明顯影響,而1000pg/ml和10000pg/ml TNF-α則會抑制SD骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化,且濃度10000pg/ml抑制作用最明顯。實時PCR結(jié)果顯示,10000pg/ml濃度TNF-α會明顯下調(diào)成骨分化相關(guān)基因Runx2、ALP和OPN的表達;Western-blot結(jié)果顯示10000pg/ml濃度TNF-α會明顯抑制Runx2蛋白的表達;對照組Runx2啟動子中總Cp G基因座中甲基化Cp G基因座的百分比為3.33%,而TNF-α處理組Runx2啟動子中總Cp G基因座中甲基化Cp G基因座的百分比為9.05%,TNF-α干預后Runx2啟動子區(qū)Cp G島甲基化水平明顯升高;染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示,10000pg/ml濃度TNF-α干預SD骨髓間充質(zhì)干細胞,會明顯抑制組蛋白H3K4的三甲基化,同時明顯促進組蛋白H3K27的三甲基化。結(jié)論:股骨頭壞死患者股骨頭內(nèi)正常骨、硬化骨和壞死骨內(nèi)TNF-α含量存在明顯差異,以硬化骨TNF-α含量最高,且含量與患者性別、年齡、病因、證型、疼痛時間、ARCO分期及JIC分型均無相關(guān)性,但是JIC分型是影響硬化骨TNF-α含量的危險因素;高濃度TNF-α(1000pg/ml和10000pg/ml)會抑制SD骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化,通過增加Runx2啟動子區(qū)Cp G島甲基化水平、促進組蛋白H3K27的三甲基化及抑制組蛋白H3K4的三甲基化是TNF-α影響SD骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化的作用機制之一。
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R681.8

【參考文獻】

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本文編號：2669209