【摘要】：目的:探討粒細胞集落刺激因子介導金黃色葡萄球菌感染引起的骨量下降的關(guān)聯(lián)性及其機制方法:1、金黃色葡萄球菌性慢性骨髓炎模型的建立及驗證:白細胞計數(shù)、細菌培養(yǎng)、X線攝影、磁共振檢查等相關(guān)的驗證;2、金黃色葡萄球菌感染引起成骨能力下降導致骨量丟失:(1)Micro-CT掃描檢測骨組織并對相關(guān)參數(shù)進行分析;(2)對骨組織樣本中成骨和破骨相關(guān)基因表達進行q-PCR檢測;(3)成骨能力檢測:骨鈣素(OCN)免疫組化染色;(4)破骨能力檢測:抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色。3、G-CSF抗體能夠緩解金黃色葡萄球菌感染引起的骨量丟失:(1)生物信息學方法篩選與骨量下降相關(guān)的炎性因子;(2)臨床慢性骨髓炎患者血清G-CSF的ELISA檢測;(3)小鼠血清及骨髓上清G-CSF的ELISA檢測;(4)骨組織內(nèi)單核巨噬細胞免疫組化檢測;(5)G-CSF抗體注射后骨組織Micro-CT掃描檢測;(6)G-CSF抗體注射后白細胞計數(shù);(7)G-CSF抗體注射后骨組織OCN免疫組化檢測。4、G-CSF引起骨量丟失的機制研究:(1)小鼠前成骨細胞提取和培養(yǎng);(2)G-CSF處理前成骨細胞后相關(guān)成骨標志q-PCR檢測;(3)前成骨細胞茜素紅(Alizarin Red)染色檢測;(4)Western Blot 檢測成骨相關(guān) Wnt/β-catenin通路及BMP/Smd1通路。結(jié)果:1、金黃色葡萄球菌性慢性骨髓炎模型的建立及驗證:(1)我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在第1、2、3周白細胞計數(shù)顯著高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。而在第4、5周時白細胞下降,與對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義;(2)X線攝影檢查結(jié)果顯示注射細菌14天時,在與尾靜脈注射部位(鼠尾1/3處)相近的髂骨及尾骨出現(xiàn)了提示病灶存在的高密度影;(3)磁共振檢查結(jié)果顯示:脛骨髓腔內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)了異常的信號影;(4)細菌培養(yǎng)鑒定結(jié)果為試驗用金黃色葡萄球菌。2、金黃色葡萄球菌感染引起成骨能力下降導致骨量丟失:(1)MicroCT相關(guān)骨組織參數(shù):骨體積分數(shù)(BV/TV),骨小梁數(shù)量(Tb/N),骨小梁厚度(Tb/Th),連接密度(Con.D)均下降;以及骨小梁間隔(Tb/Sp),骨小梁模式因子(Tb.Pf)均升高;(2)成骨相關(guān)基因選擇骨鈣素(OCN)和RUNX2,q-PCR結(jié)果顯示OCN、RUNX2的表達顯著下降,而RANKL的表達無顯著改變;(3)感染組的OCN陽性成骨細胞數(shù)量顯著低于對照組的數(shù)量;(4)與對照組相比,金黃色葡萄球菌感染組內(nèi)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)陽性的破骨細胞數(shù)量有所增加,但是差異沒有統(tǒng)計學意義。3、G-CSF抗體能夠緩解金黃色葡萄球菌感染引起的骨量丟失:(1)我們發(fā)現(xiàn)粒細胞-集落刺激因子(G-CSF)在所有炎性因子中變化趨勢最大;(2)金黃色葡萄球菌性慢性骨髓炎患者血清中的G-CSF含量要顯著高于健康對照組;(3)動物感染模型的ELISA結(jié)果證實在血清及骨髓上清中的G-CSF都顯著升高,尤其在骨髓腔內(nèi)G-CSF大量表達;(4)F4/80抗體的免疫組化試驗發(fā)現(xiàn)分泌G-CSF的骨髓腔內(nèi)單核巨噬細胞的數(shù)量也顯著增加;(5)中和G-CSF以后,感染后骨量下降能夠被部分逆轉(zhuǎn)。4、G-CSF引起骨量丟失的機制研究:(1)q-PCR:與對照組相比,隨著G-CSF濃度的升高RUNX2、ALP以及Osterix的表達倍數(shù)由升高變?yōu)榻档?即低劑量10 ng/mL組具有促進RUNX2、ALP以及Osterix表達的作用,隨著濃度增加,50 ng/mL組的促進作用下降,到100 ng/mL濃度時顯著抑制RUNX2、ALP以及Osterix的表達;(2)茜素紅染色(Alizarin Red)結(jié)果顯示:與對照組相比,隨著G-CSF濃度的升高礦化結(jié)節(jié)數(shù)由升高變?yōu)榻档?即低劑量10 ng/mL組具有促進前成骨細胞礦化,結(jié)節(jié)數(shù)量增加,隨著濃度增加,50 ng/mL組的促進礦化作用下降,到100ng/mL濃度時抑制前成骨細胞的礦化;(3)G-CSF能夠通過抑制成骨相關(guān)的Wnt/β-catenin和BMP/Smd1信號通路,從而抑制成骨細胞的成骨分化能力。結(jié)論:G-CSF可能通過抑制成骨相關(guān)的Wnt/β-catenin及BMP/Smd1這兩條信號通路抑制前成骨細胞向成骨細胞分化,介導了金黃色葡萄球菌感染引起的骨量下降。
【圖文】：

博士論文果分析逡逑據(jù)對感染造模以后１、２、３、４、５周這五個時間的白細胞計數(shù)進，我們發(fā)現(xiàn)在第１、２、３周白細胞計數(shù)顯著高于對照組，差異具有＜０．０５）。而在第４、５周時白細胞下降，與對照組相比，差異無統(tǒng)組在這五個時間點的白細胞計數(shù)值無明顯波動，無統(tǒng)計學差異。：在感染第一周白細胞升高，在第二周時白細胞計數(shù)水平達到始下降，直至第四周基本恢復正常對照組水平。逡逑＾

對照組邐Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染組逡逑圖１－２造模后１４天Ｘ線影像表現(xiàn)逡逑３．２磁共振檢查逡逑同時，在金黃色葡萄球菌注射１４天后，我們用活體小動物磁共振成像系統(tǒng)逡逑對小鼠脛骨進行檢查，結(jié)果顯示，，所有金黃色葡萄球菌注射組均發(fā)現(xiàn)脛骨髓腔逡逑內(nèi)（不同小鼠出現(xiàn)在左側(cè)或右側(cè)，或者同時存在）出現(xiàn)信號改變，這提示炎癥逡逑的存在。而對照小鼠脛骨髓腔內(nèi)信號較一致，無明顯炎癥性改變。逡逑對照組邐Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染組逡逑圖１－３造模后１４天核磁共振影像改變逡逑４．細菌涂皿培養(yǎng)及鑒定結(jié)果逡逑我們?nèi)」晒堑乃枨粌?nèi)容物進行瓊脂平板培養(yǎng)，在３７°Ｃ恒溫孵箱培養(yǎng)２４小時逡逑１２逡逑
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R681.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Md Shaifur Rahman;Naznin Akhtar;Hossen Mohammad Jamil;Rajat Suvra Banik;Sikder M Asaduzzaman;;TGF-β/BMP signaling and other molecular events: regulation of osteoblastogenesis and bone formation[J];Bone Research;2015年01期

本文編號：2667527