【摘要】：由于關節(jié)軟骨和軟骨下骨及其交界處的組織學結構存在不同,仿生設計符合骨軟骨及其交界處組織細胞再生需要的支架可能是實現(xiàn)骨軟骨一體化重建的一項重要研究內(nèi)容。研究逐漸證實了富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)在骨、軟骨、韌帶等組織再生方面的積極作用,研究證實PRP促進軟骨下骨內(nèi)的祖細胞的遷出和成軟骨分化;還可促進間充質(zhì)干細胞增殖并向成軟骨細胞分化;PRP聯(lián)合間充質(zhì)干細胞則可以形成骨組織。PRP的液態(tài)特征決定了其存在缺乏機械強度的弱點。如果PRP可與人工合成的不同孔徑的多層層PLGA支架和具有多向分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細胞聯(lián)合構建細胞/支架復合體,探討多層的一體化PLGA支架的細胞接種方法的適用性和高效性,并將其置于關節(jié)部位骨軟骨缺損模型,可能會更加有利于骨與軟骨的再生修復,對后續(xù)相關研究也具有一定的借鑒意義。通過優(yōu)化設計多層PLGA支架可能利于尋求一種更高仿生度的骨軟骨支架用于骨軟骨缺損的組織工程修復技術方法。實驗目的:1.制備無孔粘合層PLGA支架。PLGA支架上層為軟骨層,中間的模擬骨軟骨交界層PLGA膜和下層的骨段。上層和下層為多孔結構。實驗制備膝關節(jié)軟骨及軟骨下骨缺損。制備自體PRP,并將其加載于無孔粘合層PLGA支架,構建PLGA/PRP復合體及關節(jié)腔內(nèi)注射PRP修復膝關節(jié)骨軟骨缺損動物模型。通過相關檢測以探討無孔粘合層PLGA以及PRP在新西蘭兔骨軟骨缺損模型修復中效應;初步闡明PRP在修復兔膝關節(jié)骨軟骨缺損模型中的作用。2.通過采集新西蘭兔骨髓獲得骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells BMSCs),與無孔粘合層的多層PLGA支架構建PLGA/BMSCs復合體,初步探索分次離心接種法在無孔粘合層PLGA支架接種的可行性以及BMSCs在體內(nèi)環(huán)境中誘導成軟骨及成骨的效應。3.通過調(diào)整PLGA支架粘合層的孔徑,獲得多孔粘合層PLGA支架和無孔粘合層PLGA支架,初步探討比較多孔粘合層PLGA支架和無孔粘合層PLGA支架聯(lián)合PRP關節(jié)腔內(nèi)注射在骨軟骨缺損修復中的效果差異。試驗方法1.PGA和PLG材料(75:25)溶于二氯甲烷后與NaCl晶體致孔劑混合均勻。置入支架模具、模壓成形、支架脫模獲得無孔粘合層PLGA支架,分別有上層0.3mm的軟骨層,中間層厚度0.3mm PLGA膜和下層3.4mm的骨段。孔隙率均為92%,軟骨層和骨段的孔徑分別為50-100μm和300-450μm。離心法制備PRP;并制備PLGA/PRP復合體;制備骨軟骨缺損(直徑4mm、深度4mm)模型。實驗組(PLGA加載PRP+關節(jié)腔注射PRP)、對照組1(空白PLGA植入組)、對照2組(缺損組的關節(jié)腔注射PRP)。在術后4周、12周、24周大體形態(tài)學、組織學、Q-PCR 方法進行 Collagen type Ⅱ、Aggrecan、Collagen type Ⅰ、Collagen type X的表達、Micro-CT掃描評估。2.實驗動物骨髓獲得原代BMSCs,貼壁培養(yǎng)、傳代,利用三代BMSCs作為種子細胞。分次離心方法將細胞接種與無孔粘合層PLGA支架的軟骨層和成骨段,電鏡掃描細胞粘附情況,小動物成像檢測細胞在PLGA支架內(nèi)的分布。PLGA/BMSCs復合體及PRP關節(jié)腔注射。術后12周大體形態(tài)、組織學、Q-PCR、Micro-CT掃描予以評估。3.制備多孔粘合層PLGA支架,中間的多孔結構為孔徑為100-150μm,制備中間層多孔粘合層PLGA支架。電鏡掃描觀察粘合層結構。制備PLGA/PRP復合體+PRP關節(jié)腔注射、術后4周、12周、24周進行大體外觀、組織學、Micro-CT掃描等評估多孔粘合層和無孔粘合層PLGA支架。實驗結果1.獲得實驗所需的無孔粘合層PLGA支架。PRP中的血小板濃度為1648.19±76.84x103/μl,血小板濃度為制備前全血中血小板濃度的5.1倍。大體評分:各時間點(4w、12w、24周)PLGA/PRP+PRP注射組評分均高于PLGA組和PRP注射組(p0.05)。組織學評估:各時間點(4w、12w、24周)PLGA/PRP組的評分均高于PLGA組和PRP注射組,Ⅱ型膠原表達以PLGA/PRP+PRP組的陽性表達最為明顯。Q-PCR檢測:各時間點(12w和24w)的Ⅱ型膠原和aggrecan表達 PLGA/PRP+PRP 組高于 PRP 注射組。Micro-CT 掃描:12w:PLGA/PRP+PRP注射組 BV/TV 為(20.50±1.29)%,PRP 注射組和 PLGA 組為(15.75+1.71)%和(17.0±2.94)%。PLGA/PRP+PRP 組的 BV/TV 值明顯高于另兩組(P=0.000)。24w:PLGA/PRP+PRP 注射組 BV/TV 為(42.25±2.63)%,PRP 注射組和 PLGA組為(34.75±5.73)%和(28.75±5.96)%。2.細胞培養(yǎng)與接種:軟骨層和成骨段離心接種細胞的百分比及接種細胞數(shù)量分別為(83.5±2.20)%、(80.5±2.50)%和 3.34x105/ml、3.22x106/ml。電鏡觀察與熒光標記證實材料內(nèi)部有大量細胞存在并粘附。大體評估:術后12周,PLGA/BMSCs復合體植入聯(lián)合PRP關節(jié)內(nèi)注射后的缺損修復得分為14±0.58。組織學評估:PLGA/BMSCs復合體植入聯(lián)合PRP關節(jié)內(nèi)注射組的組織學評分為21.80±0.58。Micro-CT 掃描:PLGA/BMSCs 復合體+PRP 注射組的 BV/TV 為(30.0±3.37)%。3.獲得具有多孔與無孔粘合層兩種不同規(guī)格的多層PLGA支架。軟骨段孔徑50-100μm,骨段的孔徑為300-450μm;粘合層分別為孔徑100-150μm多孔結構和無孔的PLGA膜結構。大體評估:4w:無孔粘合層組10.67±0.58,多孔粘合層組10.33±0.58;12w:無孔粘合層組13.67±0.58,多孔粘合層組13.33±0.58;24w:無孔粘合層組11.67±0.58,多孔粘合層組12.33±0.58。在4w和12w時兩組評分無明顯差異。組織學評估:組織學評分:4w:無孔粘合層組14.00±1.00,多孔粘合層組13.33±0.58;12w:無孔粘合層組15.67±0.58,多孔粘合層組15.67±0.58;24w:無孔粘合層組得分22.67±0.58,多孔粘合層組21.67±0.58。兩組無明顯差異(P=0.101)。Ⅱ型膠原相對表達水平檢測結果發(fā)現(xiàn)隨著隨訪時間的推移,Ⅱ型膠原由缺損邊緣逐漸向中心區(qū)域增多,分布均勻,兩組趨勢基本一致。Micro-CT掃描:12w和24w,無孔粘合層PLGA組與多孔粘合層PLGA組的軟骨下骨的區(qū)域底部及周緣存在礦化組織,中心區(qū)域礦化組織較少。實驗結論:1.關節(jié)腔注射PRP可促進關節(jié)軟骨及軟骨下骨缺損再生修復;無孔粘合層PLGA支架加載自體PRP聯(lián)合RPP關節(jié)腔注射對關節(jié)軟骨及軟骨下骨缺損再生修復作用進一步增強。2.分次離心接種法是一種適合無孔粘合層PLGA支架的細胞接種方法,接種效率較高;無孔粘合層PLGA支架聯(lián)合自體BMSCs和PRP可進一步增強軟骨下骨缺損區(qū)域的新生組織的礦化能力。3.無孔粘合層PLGA和多孔粘合層PLGA支架聯(lián)合PRP關節(jié)腔注射均具有促進關節(jié)軟骨缺損的再生修復;PLGA無孔粘合層降解較慢,PLGA多孔粘合層早期階段的機械支撐強度欠佳,容易塌陷,PLGA粘合層需要進一步優(yōu)化;多孔PLGA支架成骨段需優(yōu)化以增強骨再生能力。
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邐第一章多層ＰＬＧＡ／ＰＲＰ復合體聯(lián)合ＰＲＰ注射修復兔膝關節(jié)骨軟骨缺損模型逡逑圖１－１富血小板血漿的制備流程圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｐｌａｔｅｌｅｔ邋ｒｉｃｈ邋ｐｌａｓｍａ邋ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｃｅｓｓ．逡逑１．５．３富血小板血漿（ＰＲＰ）激活逡逑ＰＲＰ激活方法參照ＩｓｈｉｄａＫ等研宄中所述方法［２３］。按照２０：１的比例在制備逡逑的ＰＲＰ中加入ＣｌＣａ２／激活時間點為充分浸潤ＰＬＧＡ后３０ｍｉｎ。逡逑１．５．４邋ＰＬＧＡ支架的ＰＲＰ加載與植入逡逑將前述滅菌風干備用的ＰＬＧＡ支架置入６孔板內(nèi)，每孔１例。使用移液器向逡逑板孔內(nèi)加入前述激活的；ＰＲＰ液體，使ＰＬＧＡ完全浸入并浸泡ｌＯｍｉｎ。將加載ＰＲＰ逡逑的ＰＬＧＡ支架在術中利用顯微鑷子小心夾取以避免支架變形，將其植入己制備逡逑的股骨內(nèi)髁骨軟骨圓柱狀缺損處。逡逑■＾＂？｜�。。。。。保保躌蒎義賢跡保插澹校蹋牽林Ъ薌釉馗謊“逖義希疲椋紓酰潁邋澹保插澹校蹋牽鈴澹螅悖幔媯媯錚歟洌簀澹歟錚幔洌澹溴澹穡歟幔簦澹歟澹翦澹潁椋悖楨澹穡歟幔螅恚徨義希保擔凳笛槎鋟腫殄義轄常噸喚】敵攣骼及淄盟婊治匙�，，分柄_笛樽椋ǎ校蹋牽良釉兀校遙校劐義轄誶蛔⑸洌校遙校�、对照组１邋（空白ＰＬ苛植入组）、对照骈（缺损讬澳关秸r蛔㈠義仙洌校遙校�，每组１＊汖（染c恚保保ｅ義希保村義

本文編號：2666677