【摘要】：背景:下腰痛是臨床最常見的癥狀之一,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。椎間盤退變是導(dǎo)致下腰痛的主要原因,目前臨床常用治療手段療效不佳,復(fù)發(fā)率較高。既往研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)可修復(fù)退變椎間盤,但具體機(jī)制不清。最近研究證實(shí)BMSCs可通過(guò)旁分泌抗炎癥蛋白腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白6(TSG-6)發(fā)揮器官保護(hù)作用。目前尚不清楚BMSCs對(duì)退變椎間盤的保護(hù)作用是否與其旁分泌的抗炎癥蛋白TSG-6有關(guān)。因此本實(shí)驗(yàn)將利用針刺大鼠椎間盤退變模型、IL-1β誘導(dǎo)髓核細(xì)胞退變模型,深入研究BMSCs及其分泌的抗炎癥蛋白TSG-6對(duì)退變椎間盤髓核細(xì)胞的保護(hù)作用及具體機(jī)制。方法:全骨髓貼壁法及貫序酶消化法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs及椎間盤髓核細(xì)胞,并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光技術(shù)等鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞類型。本研究中我們構(gòu)建了BMSCs與髓核細(xì)胞transwell共培養(yǎng)體系及針刺大鼠椎間盤退變模型,通過(guò)Real-time PCR、Western blot及免疫組化技術(shù)檢測(cè)各組髓核細(xì)胞內(nèi)TLR2/NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵分子、蛋白聚糖(aggrecan)、Ⅱ型膠原蛋白(collagen-Ⅱ)、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)等的表達(dá)情況,運(yùn)用免疫熒光技術(shù)觀察髓核細(xì)胞內(nèi)p65蛋白胞漿-胞核轉(zhuǎn)位情況,使用ELISA試劑盒檢測(cè)髓核細(xì)胞或髓核組織炎癥因子含量,借助CCK-8法檢測(cè)髓核細(xì)胞增殖情況,經(jīng)MRI掃描觀察各組大鼠椎間盤髓核組織含水量變化,使用HE染色及番紅O-固綠染色觀察各組大鼠椎間盤形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果:全骨髓貼壁法分離的大鼠骨髓細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,漩渦樣生長(zhǎng),經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)及定向分化實(shí)驗(yàn)證實(shí)其為BMSCs。貫序酶消化法分離的髓核細(xì)胞呈多角形,免疫熒光染色證實(shí)其aggrecan及collagen-Ⅱ表達(dá)陽(yáng)性。Real-time PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示IL-1β可降低髓核細(xì)胞aggrecan、collagen-Ⅱ表達(dá),同時(shí)提高M(jìn)MP-3、MMP-13水平;BMSCs共培養(yǎng)及TSG-6重組蛋白處理均可提高退變髓核細(xì)胞內(nèi)aggrecan、collagen-Ⅱ表達(dá),同時(shí)抑制MMP-3、MMP-13表達(dá),而BMSCs的這種保護(hù)作用可被TSG-6 siRNA減弱。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)BMSCs及TSG-6可抑制退變髓核細(xì)胞內(nèi)TLR2/NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá),減少p65蛋白入核,降低細(xì)胞上清中炎癥因子含量并促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖。HE染色、MRI掃描等證實(shí)針刺可引起大鼠椎間盤結(jié)構(gòu)破壞及退變,而BMSCs移植及TSG-6注射均可修復(fù)退變的椎間盤、提高髓核組織含水量;此外,BMSCs移植及TSG-6注射可下調(diào)退變髓核組織內(nèi)TLR2/NF-κB信號(hào)通路,降低髓核內(nèi)炎癥因子及細(xì)胞外基質(zhì)降解酶含量。結(jié)論:BMSCs可通過(guò)旁分泌TSG-6下調(diào)退變髓核細(xì)胞TLR2/NF-κB信號(hào)通路,抑制其下游炎癥因子及基質(zhì)金屬蛋白酶等的合成,從而改善退變髓核組織炎癥微環(huán)境、促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖并修復(fù)退變椎間盤。
【圖文】：

14圖 1 倒置相差顯微鏡觀察大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況(100×)Figure 1 Morphological observation of BMSCs used in this study (100×)大鼠 BMSCs 原代培養(yǎng) 48h 后，部分細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，此時(shí)有大量懸浮的其他混雜細(xì)胞(A);大鼠BMSCs 原代培養(yǎng) 5 天后，可見數(shù)個(gè)細(xì)胞克隆形成，細(xì)胞呈紡錘樣、長(zhǎng)梭形(B)；第 3 代大鼠 BMSCs傳代后 24h, 細(xì)胞細(xì)胞呈紡錘樣、長(zhǎng)梭形，細(xì)胞形態(tài)單一，呈漩渦樣、聚集性生長(zhǎng)(C)；第 3 代大鼠 BMSCs 傳代后 72h, 細(xì)胞已長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿皿底，呈漩渦樣、聚集性生長(zhǎng)(D)。Morphological observation of rat BMSCs. After primary culture for 48h, some cells adhered to the cellculture dish, meanwhile, there are a large number of other mixed cells were suspended in the cell culturemedium (A);After primary culture for 5 days, several BMSCs colonies were observed，BMSCs showedfusiform or long spindle shapes (B); The passage 3 BMSCs cultured for 24h，BMSCs showed spindleshapes and the presence of vortex-like growth (C)；The passage 3 BMSCs cultured for 72h, BMSCs

上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文were long spindle in shape and were arranged in an organized fashion(D).1.3.2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原鑒定將長(zhǎng)至 80-90%融合的第 3 代 BMSCs 收集后，經(jīng)抗大鼠 CD29-PE、CD45-FITC、CD90-PE、CD34-FITC 單克隆抗體及相應(yīng)同型陰性對(duì)照抗體處理后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面抗原，結(jié)果顯示：CD29 陽(yáng)性率為 99.81%，CD90 陽(yáng)性率為 99.55%，，CD45 陽(yáng)性率為0.01%，CD34陽(yáng)性率小于0.01%。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中我們分離及體外培養(yǎng)的BMSCs純度較高(圖 2)。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R681.5

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