【摘要】：目的:探究脈沖磁場增強SPIO(superparamgnetic iron oxide,超順磁氧化鐵)標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞分化的能力以及對體內(nèi)軟骨組織缺損的修復(fù)治療。方法:SPIO合成與表征:將1 mmol三乙酰丙酮鐵,2.5 mmol 1,2-十六烷二醇,1 mmol油酸和3 mmol油胺加入到10毫升芐醚中,磁力攪拌,將所得混合物加熱至200℃達(dá)15分鐘,再加熱至300℃,回流1小時,所獲得的SPIO沉淀用低分子量兩親性烷基化PEI2000進(jìn)一步修飾,透射電鏡(TEM)觀察所合成SPIO顆粒,并通過動態(tài)光散射粒徑儀(DLS)來測SPIO的粒徑大小。脈沖磁場增強體外SPIO標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成軟骨細(xì)胞分化的能力以及TGF-β/SMAD信號通路的探究:提取3-7天SD大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)傳代至第三代,MTT檢測在不同濃度SPIO對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞毒性的影響。通過普魯士藍(lán)染色,觀察不同濃度SPIO標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)。實驗分組為:對照組,SPIO組,PMF組,PMF-SPIO組。MTT篩選出脈沖磁場下最佳的時長。Annexin V~+/PI~-來驗證不同條件下各個組別對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡影響。MTT驗證在不同天數(shù)1、2、3、4、5天脈沖磁場對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分組,不加TGF-β~—組(B組,BP組,BS組,BSP組)和加TGF-β~+組(BT組,BTP組,BTS組,BTSP組)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)7天,14天和21天,進(jìn)行GAG/DNA的檢測,成軟骨分化的特殊標(biāo)志基因Acan、Col2a1和Sox9表達(dá)檢測。各個實驗組中通過免疫蛋白印記(WB)驗證脈沖磁場刺激的條件下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成軟骨細(xì)胞的過程中TGF-β/SMAD信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,檢測其有關(guān)蛋白的表達(dá)變化水平,從而驗證脈沖磁場在細(xì)胞水平的影響。脈沖磁場來刺激SPIO標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對體內(nèi)軟骨缺損再生的驗證:MRI來檢測SPIO標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的T_2信號值,以及植入SPIO標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞關(guān)節(jié)腔內(nèi)的T_2信號值。構(gòu)建關(guān)節(jié)軟骨缺損模型,將不同組別(B組、BP組、BS組、BSP組)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞注射到關(guān)節(jié)腔內(nèi)對缺損部位進(jìn)行修復(fù)。在第八周后取材,并對關(guān)節(jié)進(jìn)行大體評分觀察其修復(fù)情況,固定后組織切片,進(jìn)行HE染色,番紅固綠染色以及免疫組化染色,來觀察不同組之間的修復(fù)效果。結(jié)果:制備出,在形態(tài)上是粒徑大小均一的SPIO納米顆粒。MTT驗證在SPIO濃度為10μg/mL,20μg/mL,30μg/mL和40μg/mL的條件下相比于對照組,對細(xì)胞活性沒有影響。普魯士藍(lán)染色驗證了隨著SPIO濃度的增加,細(xì)胞基質(zhì)中藍(lán)色鐵顆粒顯著的增多。在脈沖磁場的條件下篩選出其最佳的作用時長為30min。流式結(jié)果顯示了SPIO和脈沖磁場對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞沒有凋亡的影響。此外還驗證了在脈沖磁場刺激的條件下SPIO標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖率顯著的上升。在脈沖磁場的條件下SPIO標(biāo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞GAG的分泌以及相關(guān)軟骨特殊基因Acan、Col2a1和Sox9的表達(dá)水平都顯著升高。在蛋白水平,驗證了脈沖磁場的條件下能夠增強SPIO標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在分化過程中的TGF-β/SMAD信號通路。體內(nèi)實驗通過取組織觀察,以及相關(guān)的組織學(xué)染色,驗證了脈沖磁場的條件下能夠增強SPIO標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對軟骨缺損部位的修復(fù)。結(jié)論:在本研究中,脈沖磁場代表了一種非侵入性方法來增強骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖以及軟骨特異性基因表達(dá),通過暴露于脈沖磁場SPIO標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞改善其向軟骨形成分化能力,提供連續(xù)和穩(wěn)定的刺激,克服了先前使用生長因子在體內(nèi)的應(yīng)障礙。并為軟骨再生的提供有效線索。我們的研究結(jié)果顯示代表一種可以實現(xiàn)的基于細(xì)胞對受損軟骨組織治療策略。
【圖文】：

SPIO的TEM結(jié)果圖

圖 1.2 SPIO 納米顆粒的 DLS 圖Figure 1.2 The DLS specture of SPIO鐵納米顆粒已成為最常用的磁性納米顆粒，在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用[24]。因為他們的低成本，低毒性，，具有獨特的超方面，制備具有所需性能和高潛力應(yīng)用型的氧化鐵納重要的[25]。當(dāng)氧化鐵納米顆粒被設(shè)計用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)米顆粒的尺寸大小和流體力學(xué)[26]。適當(dāng)?shù)牧黧w動力學(xué)和于控制血管中的納米顆粒濃度分布，改善了循環(huán)系統(tǒng)中透性和易清除性。例如，研究報道表明，小的納米顆粒
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R68

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本文編號：2665460