發(fā)布時間：2020-05-15 17:05

【摘要】：研究背景乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤疾病,發(fā)病后常轉移到骨組織中,一旦發(fā)生轉移將會導致較差的臨床預后。由于骨骼細胞構成的特殊性,對化療藥物的攝取常常發(fā)生在非靶點區(qū)域,并在癌細胞和正常細胞中產生相似的細胞毒性。盡管學者們投入了大量的精力深入研究,但仍無法改變這一現狀。因此,抑制癌細胞的侵襲性,有效控制癌細胞的轉移,改善轉移后的診療效果是我們努力的方向。臨床上對乳腺癌骨轉移的治療方法主要集中在手術切除、內分泌治療、化療和放療等方面。但由于骨骼特殊的病理生理特點,癌細胞在發(fā)生骨轉移后,可選擇的治療方法有限,治療效果并不理想,臨床預后也較差。且骨轉移通常是多發(fā)轉移,因此通過局部放射治療或外科手術治療是難以徹底消除骨轉移病灶。就化療而言,由于骨骼內血循環(huán)流量低,全身用藥難以在骨骼部位產生足量的藥物濃度。為維持有效的化療藥物濃度,提高藥物對骨骼轉移病灶的治療效果,通常需要加大藥物劑量或者增加給藥次數,二者均可能導致嚴重的全身性毒副反應。因此,設計一種具有高選擇性和高效性的藥物遞送系統(tǒng),將抗腫瘤藥物更好地靶向運輸至骨組織中的癌細胞,以獲得更好的治療效果,成為解決該臨床問題的一大課題。本研究采用八天門冬氨酸(ASP8)和葉酸(FR)設計了雙重修飾的阿霉素(DOX)脂質體遞送藥系統(tǒng)(A/F-LS),其中ASP8能夠靶向骨組織,而葉酸則可進一步靶向骨組織中的腫瘤細胞,二者雙重修飾可有效地將脂質體包裹的化療藥物遞送至骨組織中的腫瘤細胞,并盡可能地減少正常細胞免受損傷。在試驗中我們制備了DOX-A/F-LS,對其進行表征及密度優(yōu)化,研究其藥代動力學,在動物模型體內觀察其對動物疼痛、動物生存期的影響及對體內細胞毒性等方面的作用;通過體外試驗觀察其對乳腺癌MDA-MB-231細胞生物學行為的影響等方面。綜合評估其對骨轉移癌細胞的靶向治療效果,研究結果為乳腺癌骨轉移的臨床治療奠定實驗基礎。目的1.制備雙重修飾的阿霉素脂質體,表征并優(yōu)化其密度,以提高DOX-A/F-LS對MDA-MB-231細胞的選擇性轉運的靶向性。2.通過脛骨注射MDA-MB-231細胞建立乳腺癌骨轉移小鼠模型,檢測DOX-A/F-LS在動物體內的藥代動力學、毒性和體內治療功效。3.采用細胞外試驗評價DOX-A/F-LS對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖周期的調節(jié)、遷移和侵襲能力的抑制作用及細胞外毒性,評價其抗腫瘤活性。方法1.雙重修飾脂質體的制備與密度優(yōu)化:通過合成DSPE-PEG2000-ASP8和DSPE-PEG2000-葉酸制備雙重修飾的阿霉素脂質體;再對其進行表征;采用激光粒子分析儀檢測各種脂質體的粒徑大小;應用透析法檢測各種脂質體制劑的藥物釋放;研究脂質體中不同濃度的ASP8與HA的結合效率,來確定ASP8與葉酸的最優(yōu)配比。2.雙重修飾脂質體細胞內治療功效與毒性研究:通過脛骨注射MDA-MB-231細胞建立乳腺癌骨轉移小鼠模型,分組按5mg/kg體重的等效劑量,自尾靜脈分別注入游離阿霉素、阿霉素A-LS,阿霉素F-LS和阿霉素A/F-LS,研究其藥代動力學;對小鼠體內成像進行檢測;對動物疼痛行為進行評價;觀察其體重變化及存活時間,從組織病理學和血象分析開展毒性研究,從而評估阿霉素A/F-LS的安全性。3.雙重修飾脂質體細胞外毒性及靶向性研究:采用體外細胞試驗的方法,建立細胞劃痕實驗及侵襲實驗,對比研究阿霉素A/F-LS對MDA-MB-231細胞遷移和侵襲能力的抑制作用;并應用免疫印跡檢測相關蛋白參與腫瘤相關信號通路的抑制作用;應用MTT法檢測阿霉素A/F-LS對MDA-MB-231細胞生長周期的影響作用。結果1、實驗合成了DSPE-PEG2000-ASP8和DSPE-PEG2000-葉酸功能復合物,觀察到的質荷比約為3864.154和3239.984;制備了雙重修飾的DOX-A/F-LS,采用激光粒子分析儀檢測N-LS,A-LS,F-LS和A/F-LS的粒徑大小大約在95.82±0.13nm和96.61±0.11nm之間,顯示N-LS,A-LS,F-LS和A/F-LS的大小不因ASP8或葉酸修飾而受到明顯影響。研究還顯示ASP8修飾的脂質體(A-LS)與HA結合的能力,隨著脂質體制劑中ASP8/脂質體摩爾比的增加,HA的結合量也顯著增加,脂質體上DSPE-PEG2000-ASP8和DSPE-PEG2000-葉酸的最佳密度分別為15%和10%(摩爾比)。2、通過乳腺癌骨轉移小鼠模型的尾靜脈注射5mg/kg體重的等效劑量游離阿霉素、阿霉素A-LS,阿霉素F-LS和阿霉素A/F-LS,在注射后0.083、0.25、0.5、1,2,3、4,6,8、12和24小時從頸靜脈抽取血樣,顯示脂質表面結合足夠量的ASP8和葉酸并不會損害PEG的體循環(huán)特性;活體成像獲得的數據表明A/F-LS系統(tǒng)有可能在細胞內實現藥物對轉移骨腫瘤細胞的特異性靶向轉運。在接種腫瘤細胞后的第4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24天檢測小鼠疼痛相關的行為,A/F-LS治療組可顯著減少動物退縮次數(3.25±0.63),可有效減輕動物疼痛水平。組織學和血液學的檢測指標表明,A/F-LS組只有輕微的肝臟毒性,紅細胞(RBC)和白細胞(WBC)水平沒有明顯下降,顯示A/F-LS在很大程度上減輕了DOX的細胞毒性,并且在測試劑量下相對安全。在整個實驗期間A/F-LS組小鼠的體重減輕值均小于游離DOX組,延長動物中位生存時間(27天),表明DOX-A/F-LS可通過骨靶向遞送減少非特異性細胞對其攝取,通過增強腫瘤細胞對其內吞攝取而表現出更強的抗腫瘤活性。3、細胞外DOX-A/F-LS處理MDA-MB-231細胞72h后,流式細胞儀檢測DOX-A/F-LS組S期細胞顯著降低,其中DOX-A/F-LS 1u M和10u M處理組S期細胞占比分別為18.98±8.84,13.00±7.14,明顯低于對照組32.56±7.29。細胞劃痕實驗顯示DOX-A/F-LS(10u M)組實驗細胞劃痕愈合率為50.36±1.1%,明顯低于空白對照組的79.89±1.60%(P0.05),表明DOX-A/F-LS對MDA-MB-231細胞轉移侵襲能力有顯著抑制作用。Transwell實驗與對照組對比,結果顯示DOX-A/F-LS組能有效抑制MDA-MB-231細胞的侵襲能力,高濃度處理組抑制效果更明顯,有顯著的遷移和侵襲抑制效應。免疫印跡實驗檢測p-ERK1/2、p-Akt,p-p38蛋白表達情況,結果顯示DOX-A/F-LS處理組可以顯著抑制ERK1/2、AKT的磷酸化水平,而對于p-p38沒有影響,提示AKT和ERK1/2參與了阿霉素脂質體對于MDA-MB-231細胞增值和遷移的抑制效應。MTT方法檢測含有DOX的脂質體制劑對細胞外MDA-MB-231細胞毒性,DOX-F-LS和DOX-A/F-LS的IC50值分別為17.8lμg/m L和15.3μg/m L,明顯低于對照組IC50值的100.5μg/m L和94.9μg/m L。結果表明,經過葉酸修飾后的阿霉素脂質體可顯著抑制細胞表面葉酸受體過表達的MDA-MB-231細胞增殖,有助于將藥物進一步轉運至骨組織中的腫瘤細胞,增強對骨轉移腫瘤的治療效果。結論1.DOX-A/F-LS的粒徑大小大約在95.82±0.13nm和98.61±0.11nm之間,脂質體上ASP8和葉酸的最佳密度分別為15%和10%(摩爾比),可有效提高藥物轉運的主動靶向性,降低內在超越依賴的EPR效應。2.DOX-A/F-LS是理想的乳腺癌骨轉移藥代動力學模型,適用于通過全身給藥對MDA-MB-231細胞的靶向藥物遞送,減少對健康細胞的毒性。3.DOX-A/F-LS在乳腺癌骨轉移進程中能有效調節(jié)MDA-MB-231細胞的增殖周期,顯著抑制癌細胞轉移和侵襲能力作用,可有效的發(fā)揮抗腫瘤作用。
【圖文】：

修飾而來的。這兩種功能物質合成過程如圖1所示。用半胱氨酸終止ASP8以引入游離巰基（-SH），然后通過巰基-馬來酰亞胺反應與DSPE-PEG2000-Mal偶聯，這使得ASP8能夠在特定位點（-SH）綴合（圖1-1 A）。為了制備DSPE-PEG2000-葉酸，我們通過碳二亞胺介導與葉酸偶聯先制備成DSPE-PEG2000-NH2（圖1-1 B）。MALDI-TOF MS結果證實了成功合成了DSPE-PEG2000-ASP8和DSPE-PEG2000-葉酸，觀察到的質荷比約為3864.154和3239.984（圖1-1 C 和圖1-1 D，由箭頭標記），理論質荷比分別為3864和3239，然后將最終產物用于制備N-LS、A-LS、F-LS和A/F-LS的靶向脂質體。圖1-1 靶向脂質體功能結合物合成（A）:引入游離巰基（-SH）與DSPE-PEG2000-Mal偶聯，ASP8在特定位點（-SH）綴 合 ；（ B ） : 以 碳 二 亞 胺 介 導 與 葉 酸 偶 聯 制 備 成 DSPE-PEG2000-NH2 ；（C-D）:MALDI-TOF MS結果證實合成功能結合物，觀察質荷比。4.2 脂質體的表征表1-1總結了四種不同脂質體制劑的理化性質。所有脂質體的EE（%）值最小在91.7 ± 1.2；最大值在94.5 ± 1.8，四個類型脂質體的EE（%）值均大于90%

空軍軍醫(yī)大學博士學位論文-39-也與使用激光粒子分析儀測定的粒徑相似，見圖1-2（B）。表明雙重修飾后的脂質體不會影響藥物遞送系統(tǒng)的作用發(fā)揮，也不會改變其在體內、體外被攝取，吸附在血管內外和藥物的釋放，從而保證其穩(wěn)定性。圖1-2 脂質體表征及藥物釋放性能（A）通過透射電子顯微鏡觀測 A/F-LS 形態(tài)及分布；（B）應用 TEM 圖像檢測粒徑大小與激光粒子分析儀測定的比較；（C）采用透析法檢測各種脂質體制劑的藥物體外釋放；（D）A/F-LS 用含有 10%FBS 的細胞培養(yǎng) 48 小時評估脂質體在 10%FBS 中的體外穩(wěn)定性。4.3 脂質體藥物的釋放圖1-2（C）顯示的是采用DOX釋放試驗以檢測脂質體的藥物釋放性能，結果顯示，，N-LS，A-LS，F-LS和A/F-LS四種脂質體放入含有0.5%Tween-80（w/w）的磷酸鹽緩沖溶液介質的透析袋中，在1/2小時、1小時、2.5小時、5小時、7.5小時,10小時等各個時間點
【學位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9;R738

【參考文獻】

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本文編號：2665363