【摘要】：目的:椎間盤退行性改變(intervertebral disc degeneration,IDD)的基本病理改變之一為組織內(nèi)微血管生成,但尚無關(guān)于血管生成素(angiopoietin)在IDD中的相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)擬探討血管生成素1(angiopoietin-1,Ang-1)和血管生成素2(angiopoietin-2,Ang-2)在椎間盤髓核組織中的表達(dá),并通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究闡明它們在IDD中的作用及其機(jī)制。方法:采用免疫組化法檢測椎間盤髓核組織中Ang-1和Ang-2的表達(dá),并提取組織蛋白進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn),q RT-PCR檢測基因m RNA水平,體外提取和培養(yǎng)原代髓核細(xì)胞,置于1.0Mpa靜態(tài)壓力下培養(yǎng),采用黏附實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞黏附能力,MTT法測定細(xì)胞活力,Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡,并進(jìn)一步構(gòu)建鼠尾椎間盤Ang-2注射模型,進(jìn)行MRI檢測。最后通過Co-IP實(shí)驗(yàn)探究其中涉及的信號通路機(jī)制。結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示,Ang-2在退變椎間盤髓核組織中表達(dá)較正常組織高,髓核組織中Ang-2/Ang-1比例隨著患者退變等級增加而上升。在體外實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)給髓核細(xì)胞施加1Mpa大氣壓強(qiáng)時(shí),細(xì)胞中Ang-2/Ang-1 m RNA和蛋白質(zhì)水平增加,進(jìn)一步功能研究發(fā)現(xiàn),Ang-2能夠使髓核細(xì)胞粘附能力和活力下降,促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡。鼠尾椎間盤注射模型結(jié)果顯示,Ang-2注射組較對照組椎間盤MRI信號變低,Ang-2顯著促進(jìn)了椎間盤退變等級的增加。Ang-1激活的Tie2受體和纖粘蛋白(fibronectin,FN)激活的整合素受體α5β1相互作用,募集下游局部粘著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)蛋白,共同作用激活了髓核細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt信號通路,而Ang-2拮抗上述過程。結(jié)論:椎間盤退變過程中,Ang-2持續(xù)釋放導(dǎo)致Ang-2/Ang-1比例增高,通過抑制PI3K/Akt信號通路抑制了髓核細(xì)胞粘附能力和活力,加劇了細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)為椎間盤退變的病理機(jī)制研究提供了新思路。
【圖文】：

處理壓強(qiáng)為1.0 MPa 氣壓[22]。自制不銹鋼密閉容器，自帶氣壓計(jì)和溫度計(jì)用以監(jiān)測相應(yīng)指標(biāo)。細(xì)胞培養(yǎng)板放于容器中下部的托盤上，底部加入適量的雙蒸水以保持濕潤氛圍（圖1）。將壓力鍋放于 37℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱，將含壓縮氣體（CO2/空氣比為5/95的混合氣體）泵入自制密封容器內(nèi)，充氣速度保持持續(xù)漸進(jìn)，直到壓力值達(dá)到 1.0MPa [23]。圖 1 自制壓力培養(yǎng)容器外觀圖2.2.7 細(xì)胞免疫熒光染色細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：（1） 髓核細(xì)胞如上壓力處理后進(jìn)行爬片。在培養(yǎng)板中用 PBS 潤洗細(xì)胞爬片，3 次，3min/次；

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文28圖3 (A、B) 在壓力處理0h、12h、24h、36h、48h后，WB檢測髓核細(xì)胞中Ang-1和Ang-2蛋白水平并定量；(C) 在壓力處理0h、12h、24h、36h、48h后，，WB檢測髓核細(xì)胞中Ang-1和Ang-2 mRNA水平；(D) 在壓力處理0h、12h、24h、36h、48h后，Elisa檢測上清液中Ang-1和Ang-2 蛋白分泌水平；(E) 在壓力處理0h、12h、24h、36h、48h
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R681.5

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本文編號：2663685