【摘要】：前言:骨肉瘤(osteosarcoma)是青少年中最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤之一,預后較差。目前臨床上對骨肉瘤的治療主要采用手術+化療等綜合治療,使得患者的五年生存率較以前得到顯著的提高。但是大劑量化療帶來的嚴重副反應以及多藥耐藥等問題使得骨肉瘤的治療進展收到限制。azurin就是近年發(fā)現(xiàn)的一種很有前途的抗腫瘤生物蛋白之一。近期的研究證實azurin在體外和荷瘤裸鼠體內可選擇性的誘導某些黑色素瘤和人乳腺癌等腫瘤細胞凋亡,同時發(fā)現(xiàn)azurin在體內誘導腫瘤細胞凋亡時,對機體無毒副作用。針對骨肉瘤容易產生化療耐藥的特點,我們使用細菌氧化還原蛋白azurin處理骨肉瘤細胞U20S后發(fā)現(xiàn)其具有明顯誘導細胞凋亡的作用。而azurin的合成價格昂貴,我們通過基因工程的方式制備了表達azurin細菌株,通過摸索表達條件,達到最優(yōu)化效果。并利用重組的azurin蛋白,證實了其誘導凋亡的活性,并探索p53基因在骨肉瘤細胞中對azurin誘導的凋亡有何影響。研究目的:1.我們通過基因重組的方式將azurin的cDNA插入DH5α菌株,并證實其表達azurin蛋白。通過探索不同的細菌表達條件,摸索最佳條件已使其表達最大化。2.p53在azurin誘導的凋亡過程中具有重要的功能,我們嘗試使用具有不同p53基因的骨肉瘤細胞株來研究野生型和突變型p53是否影響azurin的抗腫瘤效果。3.通過使用基因干擾技術,更準確高效的探索p53基因與azurin之間是如何作用來產生抗腫瘤效果的。研究方法:1.我們使用已有的pqe30/azurin質粒,該質粒中含有azurin的cDNA,通過pGEM T質粒轉染系統(tǒng)將其轉染進入DH5 α菌株。通過改變細菌孵育的溫度、時間以及誘導劑ITPG的濃度,探索最佳的表達條件;2.我們使用含有野生型p53的U20S細胞株以及含有突變型p53的MG-63細胞株來研究azurin對不同p53基因細胞的影響。我們通過使用已知作用濃度的azurin分別作用這兩個細胞株不同時間,通過MTT來檢測細胞存活,通過顯微鏡觀察細胞形態(tài),通過電子顯微鏡觀察細胞超微結構變化,通過流式細胞儀檢測細胞周期改變,通過RT-PCR檢測凋亡相關基因表達以及通過western blot檢測凋亡蛋白的表達水平。以此來研究不同p53表達水平下azurin作用的變化;3.我們選擇具有野生型p53的U20S細胞株,使用構建的p53 siRNA來干擾細胞內p53的表達,再次使用azurin作用細胞,檢測細胞周期,細胞形態(tài),凋亡相關蛋白等表達,來定位azurin的作用靶點。研究結果:1.當外界條件不變時,使用pqe30/azurin質粒轉染的DH5α菌株在37攝氏度,0.8ug/ml的ITPG作用5小時后表達效率最高;2.由于MG-63細胞株為p53突變型,而U20S為野生型,因此在azurin作用后兩種有明顯差異。Azurin可以顯著誘導U20S發(fā)生凋亡,其凋亡相關的細胞形態(tài),超微結構變化均被觀察到,同時細胞周期發(fā)生明顯變化,凋亡相關蛋白水平明顯上升,特別是與p53相關的Bax和Bcl-2的變化最為顯著。而在MG-63細胞中這些變化均不明顯。說明,p53可能在azurin誘導骨肉瘤細胞凋亡中是有重要作用的。但是,由于azurin是一種蛋白分子,其在細胞內的作用較為復雜,因此需要更精確的研究來證實。于是,我們再一次設計實驗。3.我們通過使用p53 siRNA+azurin處理U20S細胞,由于p53 siRNA能且只能抑制p53基因的表達,我們發(fā)現(xiàn)此時使用azurin處理后更多的細胞存活,較低的凋亡率,caspase-3活性、Bcl-2的上調程度、Bax的下調程度均低于對照組,即未使用p53 siRNA抑制組。在TUNEL檢測中,p53 siRNA+azurin處理后的細胞陽性率低于對照組。說明p53 siRNA可以抑制由azurin引起的凋亡。由于使用p53 siRNA為瞬時轉染技術,隨著時間的推移,其功能會出現(xiàn)下降。因此我們觀察到在作用72小時后,再次出現(xiàn)凋亡相關的反應。說明,azurin是和p53結合后才能發(fā)揮作用,它可以直接作用于上游而引發(fā)下游各相關產物的變化。研究還發(fā)現(xiàn)p53的調控細胞周期中可能出現(xiàn)類似癌基因的作用,而azurin的結合可以逆轉這一功能。結論:本研究通過使用RNA干擾技術精確的將azurin的作用靶點定位于p53基因,證實了其確實通過與p53結合產生作用,解釋了 azurin在一些細胞株上誘導凋亡作用較弱的原因,并發(fā)現(xiàn)p53在野生型細胞株中類似癌基因的作用,為進一步探索腫瘤的發(fā)生及基因治療開拓道路。
【圖文】：

１．１邋？邋１．２邋ｐｑｅ３邋Ｏ／ａｚｕｒｉｎ邋質粒逡逑含有ａｚｕｒｉｎｃＤＮＡ序列，由本研究小組制備、儲存。逡逑１．１．１．３邋ｐＧＥＭＴ質粒轉染系統(tǒng)購自Ｐｒｏｍｅｇａ．（圖１）逡逑２逡逑

通急
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R738.1

【參考文獻】

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本文編號：2660035