發(fā)布時(shí)間：2020-05-11 11:04

【摘要】：【背景】骨肉瘤是最常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤,好發(fā)于兒童和青少年。新輔助化療聯(lián)合手術(shù)的綜合治療方法顯著提高了骨肉瘤患者的生存率。常用的化療藥物是順鉑、阿霉素以及氨甲喋呤。在過(guò)去的30年中,由于化療藥物耐藥的出現(xiàn),骨肉瘤患者對(duì)化療藥物的反應(yīng)性下降,常常導(dǎo)致骨肉瘤治療的失敗。即使增加藥物種類或加大藥物劑量,也不能增加這些患者對(duì)藥物的敏感性,腫瘤仍將較快的出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,最終5年生存率會(huì)下降到20%。由此可見,化療藥物耐藥是出現(xiàn)這種預(yù)后不良的主要原因。因此,為了提高骨肉瘤患者生存率,改善預(yù)后,深入研究骨肉瘤患者出現(xiàn)化療藥物耐藥的分子機(jī)制是非常重要的。熱休克蛋白家族是一種高度保守的蛋白質(zhì),在細(xì)胞存活中起著重要作用。特別是在多種應(yīng)激條件下,例如缺氧、化療和急性損傷等,熱休克蛋白廣泛參與多種細(xì)胞保護(hù)機(jī)制。那么,作為熱休克蛋白家族的重要成員HSP90AA1,是否參與到骨肉瘤化療藥物耐藥中,是本課題的主要研究?jī)?nèi)容。文獻(xiàn)報(bào)道,HSP90AA1除了影響腫瘤細(xì)胞存活外,還能作用于癌細(xì)胞的侵襲和遷移,并與腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)。MicroRNAs是一類小的非編碼的單鏈RNA。腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中常常伴隨著miRNAs的異常表達(dá)。越來(lái)越多的證據(jù)表明,miRNAs參與多種腫瘤生物學(xué)進(jìn)程,如增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移。那么,在骨肉瘤中,是否存在靶向調(diào)控HSP90AA1的miRNA,它對(duì)骨肉瘤的惡性行為又會(huì)有什么影響?在本課題中也將進(jìn)一步確認(rèn)�！灸康摹刻剿鞴侨饬龌熕幬锬退幍姆肿訖C(jī)制,確定治療靶點(diǎn),最終提高骨肉瘤患者生存率。確定靶向調(diào)控HSP90AA1的miRNA,通過(guò)細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定他們?cè)诠侨饬銮忠u以及轉(zhuǎn)移中的作用。【方法】通過(guò)骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA敲除HSP90AA1基因。通過(guò)HSP90AA1過(guò)表達(dá)慢病毒感染法建立穩(wěn)定表達(dá)內(nèi)源性HSP90AA1的骨肉瘤細(xì)胞系。使用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞中HSP90AA1 mRNA表達(dá)水平。使用Western blot檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞中HSP90AA1蛋白表達(dá)水平。用CCK-8法檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞的增殖率;用Annexin-V/PI染色的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率。骨肉瘤細(xì)胞自噬的檢測(cè)方法包括:Western blot檢測(cè)LC3蛋白表達(dá)、透射電鏡檢測(cè)自噬小體生成以及熒光顯微鏡觀察自噬體。mRFP-GFP-LC3雙熒光自噬體系觀察骨肉瘤細(xì)胞中自噬流。免疫缺陷小鼠接種轉(zhuǎn)染HSP90AA1 shRNA的骨肉瘤細(xì)胞建立皮下成瘤模型。采用TUNEL染色法和LC3染色法檢測(cè)腫瘤組織中凋亡和自噬的水平。機(jī)制研究中,使用Western blot檢測(cè)細(xì)胞通路相關(guān)蛋白Akt,p-Akt,mTOR,p-mTOR,JNK,p-JNK,p38和p-p38的表達(dá)水平。使用生物學(xué)預(yù)測(cè)軟件和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)調(diào)控HSP90AA1的miRNA。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)組織標(biāo)本和細(xì)胞系中miRNA-495的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染miRNA-495 mimic、miRNA-495 inhibitor和(或)HSP90AA1 shRNA后,通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞侵襲和遷移水平;實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子E-cadherin,Vimentin,Snail1和ZEB1的表達(dá)水平。通過(guò)慢病毒感染建立過(guò)表達(dá)miR-495骨肉瘤細(xì)胞系。免疫缺陷小鼠尾靜脈注射miR-495過(guò)表達(dá)骨肉瘤細(xì)胞建立肺轉(zhuǎn)移模型。HE染色觀察肺組織中轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量和大小�！窘Y(jié)果】骨肉瘤化療中常用的藥物順鉑、阿霉素和氨甲喋呤均能提高骨肉瘤細(xì)胞中HSP90AA1的表達(dá)水平�；熕幬镒饔闷陂g,過(guò)表達(dá)HSP90AA1顯著降低了骨肉瘤細(xì)胞凋亡,同時(shí)提高了細(xì)胞增殖水平,表明骨肉瘤細(xì)胞出現(xiàn)化療藥物抵抗。在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,抑制HSP90AA1的表達(dá)后恢復(fù)了骨肉瘤對(duì)化療藥物的敏感性。并且,機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)自噬參與到骨肉瘤細(xì)胞的化療藥物抵抗之中。HSP90AA1通過(guò)誘導(dǎo)自噬的發(fā)生,抑制了細(xì)胞凋亡,從而增加骨肉瘤細(xì)胞的耐藥性。在骨肉瘤細(xì)胞化療過(guò)程中,抑制HSP90AA1表達(dá)可以明顯減少自噬對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的保護(hù)作用。此外,HSP90AA1通過(guò)PI3K/Akt/mTOR細(xì)胞通路促進(jìn)自噬的發(fā)生,而細(xì)胞凋亡作用則受到JNK/P38細(xì)胞通路的調(diào)節(jié)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)顯示:HSP90AA1是miR-495的靶分子。我們首次發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤組織標(biāo)本和細(xì)胞系中miR-495的表達(dá)水平顯著下調(diào)。體外實(shí)驗(yàn)中,過(guò)表達(dá)miR-495抑制骨肉瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移,伴隨著Vimentin,Snail1 and ZEB1表達(dá)下降以及E-cadherin表達(dá)升高。抑制miR-495促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移,伴隨著Vimentin,Snail1 and ZEB1表達(dá)提高以及E-cadherin表達(dá)下降。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,過(guò)表達(dá)miR-495對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移有明顯的抑制作用。此外,抑制HSP90AA1表達(dá)成功逆轉(zhuǎn)了抑制miR-495對(duì)細(xì)胞侵襲和遷移的促進(jìn)作用。與此同時(shí),HSP90AA1過(guò)表達(dá)成功抵消了miR-495過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用�！窘Y(jié)論】化療藥物可以誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞中HSP90AA1表達(dá)。HSP90AA1作為自噬的重要調(diào)節(jié)因子,在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中均促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞化療藥物耐藥性的產(chǎn)生。HSP90AA1為改善骨肉瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)。我們首次證明,miR-495在骨肉瘤中作為腫瘤抑制因子,靶向調(diào)控HSP90AA1抑制骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲。并且,其對(duì)骨肉瘤侵襲和遷移的抑制作用是通過(guò)抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)的。miR-495也為骨肉瘤的治療提供的新的靶點(diǎn)。
【圖文】：

圖 1 骨肉瘤耐藥的發(fā)展[16]Figure 1 The question of when chemotherapy resistance emerges in osteosarcoma istill unanswered. One view is that osteosarcoma cells can change with therapy and becomcells that are resistant to agents already administered (A). Another view is thachemoresistant cells existed from the very beginning (B). After chemotherapy, sensitivcells are eliminated, leaving the resistant cells to proliferate.2、腫瘤中主要的耐藥機(jī)制腫瘤對(duì)化療藥物的耐藥性可以分為：內(nèi)在性耐藥和獲得性耐藥[17, 18]。內(nèi)在性耐藥指未接觸化療藥物之前，已經(jīng)存了對(duì)化療藥物的抵抗作用。獲得性耐藥指在接觸化療藥物后，初始對(duì)化療敏感的細(xì)胞由于藥物作用產(chǎn)生基因突變或是激活細(xì)胞內(nèi)藥物代償相關(guān)信號(hào)通路，最終產(chǎn)生了耐藥作用[19]。腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)多種不同的機(jī)制對(duì)一種或多種化療藥物產(chǎn)生耐藥性[20-23]。根據(jù)藥物種類以及細(xì)胞環(huán)境的不同，藥物靶點(diǎn)突變，藥物靶蛋白表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)，藥物清除率的下降以及 DNA 損傷修復(fù)等

圖 2 DNA 損傷對(duì)耐藥性的影響[17]2 The DNA damage induced by agents such as cisplatin cause cell cygive the cancer cell time to repair the damage, resulting in drug ral apoptosis can reduce the efficiency with which drug-induced DNcell death. Cytotoxic drugs frequently activate prosurvival adaptive activation of prosurvival signals, alterations in morphology (suesenchymal transition) and autophagy.凋亡多的證據(jù)顯示，腫瘤標(biāo)志性特征之一的抗細(xì)胞凋亡作用是造成化的原因，并且發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞會(huì)對(duì)抗凋亡蛋白表現(xiàn)出更強(qiáng)的“親和抗凋亡蛋白就成為新的治療靶點(diǎn)。其中，，研究最為廣泛的是BCL研究顯示，過(guò)表達(dá)BCL-2可以促進(jìn)白血病細(xì)胞和小鼠胸腺細(xì)胞對(duì)生耐藥[35, 36]。BCL-2蛋白家族的其他成員也被證明廣泛參與到化
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R738

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本文編號(hào)：2658358