【摘要】：脊髓損傷目前臨床上仍缺乏有效的治療手段,其傷后神經(jīng)功能修復(fù)問(wèn)題也是世界性難題,而利用外源性細(xì)胞移植替換脊髓中受損的神經(jīng)細(xì)胞有望成為治愈脊髓損傷的治療方式。成年個(gè)體脊髓中央管膜下來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)作為移植細(xì)胞來(lái)源治療脊髓損傷時(shí),具備低成瘤性、低免疫排斥反應(yīng)、無(wú)倫理道德問(wèn)題等優(yōu)勢(shì)。但是,細(xì)胞移植治療脊髓損傷時(shí),常常存在移植細(xì)胞數(shù)量不足、移植區(qū)域細(xì)胞存活率低等問(wèn)題。由此可見(jiàn),如何促進(jìn)或提高體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及生存率,對(duì)于形成足夠神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量用于移植治療脊髓損傷是至關(guān)重要的。促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)的神經(jīng)保護(hù)作用近年來(lái)得到廣泛關(guān)注,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)EPO在體外對(duì)于非成年脊髓來(lái)源神經(jīng)干細(xì)胞具有一定的促進(jìn)增殖及抗凋亡作用。若EPO也能促進(jìn)體外培養(yǎng)的成年個(gè)體脊髓中央管膜下神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)、生存,對(duì)于下一步進(jìn)行移植治療將大有裨益。然而,國(guó)內(nèi)外有關(guān)EPO對(duì)于體外培養(yǎng)成年個(gè)體脊髓中央管膜下神經(jīng)干細(xì)胞影響的研究鮮有報(bào)道,EPO處理的適宜劑量、適宜時(shí)間及相關(guān)機(jī)制也尚無(wú)定論。本課題首先成功從成年大鼠脊髓中央管膜下分離出神經(jīng)干細(xì)胞,進(jìn)而發(fā)現(xiàn)5U/ml和20U/ml的濃度和96h的處理時(shí)間可能是發(fā)揮EPO的促增殖、抗凋亡及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期作用的適宜濃度和處理時(shí)間,最后初步探討EPO影響成年大鼠脊髓中央管膜下神經(jīng)干細(xì)胞增殖、凋亡的作用機(jī)制。主要方法:1.依據(jù)前人的方法從成年大鼠脊髓中央管膜下提取出神經(jīng)干細(xì)胞,并利用細(xì)胞免疫熒光染色進(jìn)行鑒定。2.用CCK8檢測(cè)初步篩選EPO影響成年大鼠脊髓中央管膜下神經(jīng)干細(xì)胞的適宜濃度和處理時(shí)間,并通過(guò)神經(jīng)球計(jì)算、細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)適宜濃度和處理時(shí)間進(jìn)行佐證。3.繼續(xù)利用EdU檢測(cè)、TUNEL檢測(cè)及流式細(xì)胞周期驗(yàn)證適宜濃度EPO在適宜處理時(shí)間影響成年大鼠脊髓中央管膜下神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響,最后通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)的變化。4.采用SPSS20.0軟件(IBM公司)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X ±SD)或均數(shù)X表示。組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),若方差齊用LSD檢驗(yàn)、方差不齊則用Dunnett T3檢驗(yàn)作兩兩比較,當(dāng)P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)成功從成年大鼠脊髓中央管膜下提取出神經(jīng)干細(xì)胞,CCK8檢測(cè)篩選出5U/ml、20U/ml濃度的EPO可能為影響成年大鼠脊髓中央管膜下神經(jīng)干細(xì)胞增殖的適宜濃度,而適宜的處理時(shí)間可能為96h。隨后,通過(guò)神經(jīng)球計(jì)算、細(xì)胞計(jì)數(shù)、EdU檢測(cè)、流式細(xì)胞周期檢測(cè)的結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了 CCK8結(jié)果;TUNEL檢測(cè)也證實(shí)了適宜濃度及處理時(shí)間的EPO可以下調(diào)神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。最后,PCR檢測(cè)結(jié)果也證明了適宜濃度及處理時(shí)間的EPO可以上調(diào)抗凋亡、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)基因。結(jié)論:5U/ml、20U/ml濃度的EPO可能為體外促進(jìn)成年大鼠脊髓中央管膜下神經(jīng)干細(xì)胞增殖、抗凋亡、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的適宜濃度,而適宜的處理時(shí)間可能為96h。
【圖文】：

碩士學(xué)位論文逡逑球（圖２Ａ）。原代神經(jīng)干細(xì)胞傳代后培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)１周，神經(jīng)干細(xì)胞可聚逡逑集形成規(guī)則圓形、直徑約為ｌＯＯｕｍ的神經(jīng)球（圖２Ｂ）。逡逑圖２．倒置相差顯微鏡下觀察成年大鼠脊髓神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)情況逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．Ｔｈｅ邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ａｄｕｌｔ邋ｒａｔ邋ｓｐｉｎａｌ邋ｃｏｒｄ邋ｎｅｕｒａｌ邋ｓｔｅｍ邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ逡逑圖Ａ示原代成年大鼠脊髓中央管膜下神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)一周后形成大小不一神經(jīng)球；圖Ｂ示逡逑原代神經(jīng)干細(xì)胞傳代后培養(yǎng)一周形成規(guī)則圓形、直徑約為ｌＯＯｕｍ的神經(jīng)球。逡逑Ａ．Ｎｅｕｒａｌ邋ｓｔｅｍ邋ｃｅｌｌｓ邋ｄｅｒｉｖｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ａｄｕｌｔ邋ｒａｔ邋ｓｐｉｎａｌ邋ｃｏｒｄ邋ｃａｎ邋ｆｏｒｍ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｓｉｚｅｓ邋ｏｆ邋ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ逡逑ａｆｔｅｒ邋ａ邋ｗｅｅｋ邋ｏｆ邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ｃｕｌｔｕｒｅ；邋Ｂ．Ｐｒｉｍａｒｙ邋ｎｅｕｒａｌ邋ｓｔｅｍ邋ｃｅｌｌｓ邋ｃｏｕｌｄ邋ｆｏｒｍ邋ａ邋ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ邋ｏｆ邋ｒｅｇｕｌａｒ逡逑ｃｉｒｃｌｅ邋ａｎｄ邋ａ邋ｄｉａｍｅｔｅｒ邋ａｂｏｕｔ邋ｌＯＯｕｍ邋ａｆｔｅｒ邋ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｆｏｒ邋ａ邋ｗｅｅｋ．逡逑１．２．３免疫熒光染色鑒定結(jié)果逡逑體外培養(yǎng)的成年ＳＤ大鼠脊髓中央管膜下神經(jīng)干細(xì)胞行Ｎｅｓｔｉｎ和Ｓｏｘ２免疫逡逑熒光染色，，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞可以穩(wěn)定表達(dá)神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志蛋白Ｎｅｓｔｉｎ逡逑（圖３Ａ）及干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Ｓｏｘ２邋（圖３Ｂ）。免疫熒光染色同時(shí)，用Ｈｏｅｃｈｓｔ逡逑進(jìn)行核染色標(biāo)記（圖３Ｃ）。拍照后將Ｎｅｓｔｉｎ

體外培養(yǎng)的成年ＳＤ大鼠脊髓中央管膜下神經(jīng)干細(xì)胞行Ｎｅｓｔｉｎ和Ｓｏｘ２免疫逡逑熒光染色，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞可以穩(wěn)定表達(dá)神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志蛋白Ｎｅｓｔｉｎ逡逑（圖３Ａ）及干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Ｓｏｘ２邋（圖３Ｂ）。免疫熒光染色同時(shí)，用Ｈｏｅｃｈｓｔ逡逑進(jìn)行核染色標(biāo)記（圖３Ｃ）。拍照后將Ｎｅｓｔｉｎ和Ｓｏｘ２邋（圖３Ｄ）、Ｎｅｓｔｉｎ和Ｈｏｅｃｈｓｔ逡逑（圖３Ｅ）的圖片進(jìn)行融合。逡逑１３逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R651.2

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