【摘要】：隨著經(jīng)濟的高速發(fā)展,高速率的交通工具已廣泛普及,由此帶來的創(chuàng)傷發(fā)生率也逐年提高。創(chuàng)傷后感染引起膿毒癥(sepsis)的幾率也大大提高,隨之出現(xiàn)多器官功能衰竭(Multiple Organ Dysfunction Syndrome,MODS)的發(fā)生率和死亡率也隨之提高~1�，F(xiàn)代創(chuàng)傷傷情復(fù)雜,死亡率高居不下,創(chuàng)傷患者多為男性青壯年,社會代價極高。因此,創(chuàng)傷被納為國家疾病控制計劃。目前多數(shù)學(xué)者認為膿毒癥的發(fā)病基礎(chǔ)是全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),繼而發(fā)生嚴重膿毒癥和膿毒癥休克~2。因此,如何防治膿毒癥是臨床醫(yī)學(xué)面臨的一個難題。進入21世紀以來,隨著干/祖細胞技術(shù)和理論的迅猛發(fā)展,嚴重創(chuàng)傷后膿毒血癥及MODS的機制研究也出現(xiàn)了新的契機。研究表明,血液循環(huán)中具有多向分化功能的一類祖細胞在炎癥因子的刺激下從骨髓中動員并遷徙進入受損的組織中,然后分化成為內(nèi)皮細胞參與修復(fù)。內(nèi)皮細胞不僅是炎癥反應(yīng)的參與者,還是首先受損的靶細胞。內(nèi)皮細胞的損傷后造成了內(nèi)皮功能不全,目前認為這可能是器官功能障礙的始發(fā)環(huán)節(jié)。1997年,Asahara~1等首次分離并證實人外周血存在著能分化為血管內(nèi)皮細胞的內(nèi)皮祖細胞(Endothelial progenitor cells,EPCs),這些細胞具有增殖、遷徙和分化為成熟內(nèi)皮細胞的能力,人們開始了對內(nèi)皮祖細胞的各方面研究。內(nèi)皮祖細胞定居于骨髓,在創(chuàng)傷后或炎癥因子的刺激下可以被動員到外周循環(huán),由于其具有大量增殖及向缺血部位歸巢的特性,在創(chuàng)傷后參與血管形成修復(fù)并維持血管內(nèi)皮穩(wěn)定等關(guān)鍵作用。最近研究發(fā)現(xiàn)通過進行自體移植EPCs發(fā)現(xiàn),雖然MODS的發(fā)生率和死亡率均出現(xiàn)下降,但是外源性EPCs的移植在病態(tài)環(huán)境下并未有效分化為內(nèi)皮細胞,削弱了對重要器官的修復(fù)功能。提示在膿毒癥發(fā)生和發(fā)展過程中的局部缺血、缺氧的內(nèi)環(huán)境不利于EPCs的定向分化和促進血管內(nèi)皮的修復(fù)。如何使EPC在病態(tài)內(nèi)環(huán)境中最大程度定向分化為血管內(nèi)皮細胞,探索調(diào)控EPC定向分化的機制是目前研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn),Slit2蛋白分布于肺、肝臟和腎臟等重要血管的內(nèi)皮細胞。Robo4是Slit2蛋白的單次跨膜受體,其特異性表達于血管內(nèi)皮細胞,參與血管新生和維持血管內(nèi)皮功能穩(wěn)定。EPC表明Robo4表達強度和EPC向成熟血管內(nèi)皮定向分化及維持血管內(nèi)皮穩(wěn)定密切相關(guān)~3。在小鼠膿毒血癥過程中,給予外源性Slit2后,可通過Robo4激活血管內(nèi)皮鈣離子依賴性粘連蛋白(VE-cadherin),防止其被胞內(nèi)攝取,從而增強血管內(nèi)皮穩(wěn)定性,增強內(nèi)皮細胞之間的粘附力,明顯提高膿毒血癥小鼠的存活率~4。本研究將探討在膿毒癥發(fā)生過程中Robo4基因表達對EPCs數(shù)量和功能的影響,及其誘導(dǎo)EPCs定向分化作用,為臨床防治膿毒癥探索新的治療靶點提供理論和實驗基礎(chǔ)。本研究共分為三個部分,首先通過基因敲除技術(shù)構(gòu)建Robo4~(-/+)、Robo4~(-/-)小鼠,通過盲腸穿孔+腹腔注射內(nèi)毒素(LPS)制造出創(chuàng)傷后基因敲除小鼠的膿毒癥模型。然后動態(tài)觀察創(chuàng)傷后膿毒癥發(fā)展過程中EPCs內(nèi)Robo4表達水平和內(nèi)皮祖細胞數(shù)量變化。最后對三種不同基因表達小鼠骨髓來源的EPCs進行體外培養(yǎng)和功能鑒定。第一部分多器官功能障礙小鼠模型的建立目的:建立基因敲除小鼠膿毒癥模型,為研究Robo4影響內(nèi)皮祖細胞增殖和分化提供實驗基礎(chǔ)。方法:將體重20-25g的Robo4~(-/+)、Robo4~(-/-)和WT三種基因類型的小鼠100只分為2組:實驗組(M組)90只,施行腹腔內(nèi)毒素注射+盲腸穿孔;對照組(C組),施行假手術(shù)。觀察各組動物的癥狀、體征、生存率、臟器功能指標(ALT、AST、Cr)、炎性因子(TNF-α、IL-1β、VEGF)并觀察主要臟器的大體及顯微鏡下病理改變。結(jié)果:實驗組小鼠的癥狀、體征與功能指標均發(fā)生明顯變化,肺、肝、心、腎及胃腸道等臟器病理改變嚴重。實驗組和對照組MODS發(fā)生率為(82.2%,0),死亡率(75%,10%),顯著高于對照組。結(jié)論:采用腹腔注射內(nèi)毒素+盲腸穿孔的方法,可以成功地復(fù)制出小鼠膿毒癥模型,且有較高的死亡率和可重復(fù)的穩(wěn)定性,并可進一步發(fā)展成為MODS。第二部分膿毒癥進展過程中EPCs數(shù)量的變化及EPCs內(nèi)Robo4表達水平變化目的:監(jiān)測膿毒癥各個階段正常小鼠骨髓中內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量變化,檢測EPCs Robo4的mRNA和蛋白水平變化,探討Robo4表達水平與EPCs數(shù)量變化的相關(guān)性。方法:按照第一部分造模后,分別在正常狀態(tài)下、注射內(nèi)毒素2小時、4小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時取骨髓,按照密度梯度離心法獲得單個核細胞(PMC,peripheral mononuclear cell),按5×10~5PMC/孔的密度種于鋪有纖維連接蛋白(FN)的培養(yǎng)板中培養(yǎng),培養(yǎng)48小時后收集未貼壁細胞,再按1×10~5PMC/孔的密度接種于FN包被的培養(yǎng)板中進行培養(yǎng),培養(yǎng)72小時進行貼壁細胞的計數(shù)。取1×10~5細胞進行裂解,利用RealTime-PCR檢測MODS各個階段EPC中Robo4的mRNA和蛋白水平變化。結(jié)果:膿毒癥發(fā)展過程中,Robo4表達水平逐漸升高,至T4達到峰值,隨后逐漸下降;內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量先增加,在T5時達到峰值,隨后出現(xiàn)明顯下降。相關(guān)性分析表明,二者在膿毒癥進展過程中的變化成正相關(guān)。結(jié)論:在LPS介導(dǎo)的小鼠膿毒癥模型中,Robo4表達水平與骨髓中EPCs數(shù)量具有相關(guān)性,因此Robo4可能參與調(diào)控EPCs的增殖。第三部分三種不同基因表型的小鼠骨髓來源EPCs培養(yǎng)鑒定和功能特征比較目的:對三種不同基因表表型小鼠骨髓來源的EPCs進行分離、培養(yǎng)、鑒定和功能比較。方法:從小鼠骨髓分離出單個核細胞,進行誘導(dǎo)分化培養(yǎng),對培養(yǎng)至P6代的EPC進行細胞形態(tài)學(xué)特征、流式細胞儀、雙吞噬功能及體外血管形成功能等方法進行鑒定,并對照分析。結(jié)果:三種不同基因表達的EPC鑒定如下:貼壁細胞均特異性攝取了Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1,攝取率均超過80%。免疫組化:Robo4~(-/-)組:CD133(+)、CD34(+)、CD31(++)、KDR(++);Robo4~(+/-)組:CD133(+)、CD34(+)、CD31(+++)、KDR(+++);WT組:CD133(+)、CD34(+)、CD31(+++)、KDR(+++)。流式細胞儀技術(shù)鑒定:Robo4~(-/-)組:CD133陽性率:17.25±6.43%;CD34陽性率:48.75±6.83%;CD31陽性率:72.53±12.38%;KDR陽性率:87.25±10.23%;Robo4~(+/-)組:CD133陽性率:16.55±7.29%;CD34陽性率:46.65±7.23%;CD31陽性率:75.93±11.28%;KDR陽性率:89.25±11.33%;WT組:CD133陽性率:18.25±8.57%;CD34陽性率:47.15±5.72%;CD31陽性率:74.61±10.69%;KDR陽性率:88.25±11.35%。體外血管生成功能:Robo4~(-/+)組:28.49±4.38個/HP;Robo4~(-/-)組:25.82±3.62個/HP;WT組:42.32±3.92個/HP(P0.05)。粘附功能:貼壁率(Robo4~(-/+)組:42.7±3.1%;Robo4~(-/-)組:39.5±1.7%;WT組:64.5±2.6%(P0.05))。遷徙功能:遷徙率(Robo4~(-/+)組:18.5±1.7%;Robo4~(-/-)組:13.3±2.6%;WT組:27.5±1.8%(P0.05))。增殖功能:Robo4~(-/+)組:23.06±2.63×10~4;Robo4~(-/-)組:19.24±2.65×10~4;WT組:40.33±3.65×10~4(P0.05)。結(jié)論:Robo4~(+/-)、Robo4~(-/-)和WT三種基因來源的EPC的細胞形態(tài)和鑒定無明顯差別�；蚯贸∈驟PCs的血管形成能力、遷徙功能、粘附功能和細胞增殖能力要劣于野生型組。小結(jié):通過CLP+腹腔LPS注射建立復(fù)制小鼠膿毒癥模型與臨床膿毒癥發(fā)生的常見誘因和實際過程相近。膿毒癥發(fā)展過程中Robo4表達水平和內(nèi)皮祖細胞數(shù)量呈上升趨勢,而隨著死亡的升高,二者逐漸下降。通過對三種基因表達小鼠誘導(dǎo)分離骨髓來源EPCs比較分析,發(fā)現(xiàn)Robo4基因敲除小鼠與野生型小鼠的骨髓源性的EPCs在表型鑒定、形態(tài)學(xué)特征、雙吞噬功能基本一致�；蚯贸∈笤谶w徙功能、血管形成功能、粘附功能和增殖功能上明顯低于野生型小鼠。證實Robo4基因表型對EPCs的部分功能存在調(diào)控作用。
【圖文】：

2. 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析本部分數(shù)據(jù)采用 SPSS17.0 統(tǒng)計軟件分析。肝腎功能和炎癥指標的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（ x±s）表示。各組間樣本均數(shù)采用單因素方差分析（ANOVA），組內(nèi)比較采用 t 檢驗，MODS 的發(fā)生率和死亡率采用 2檢驗。以 P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01 為差異具有顯著性。二、 結(jié)果(一) 基因敲除小鼠鑒定培育1.質(zhì)粒構(gòu)建及打靶策略完成構(gòu)建的打靶質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶及測序鑒定同源臂插入及方向，打靶質(zhì)粒圖譜見圖 1-1。用 PvuI 線性化后用于胚胎干細胞打靶，打靶策略見圖 1-1。

圖 1-2 Robo4 條件性基因剔除示意圖（2） 同源重組 ES 細胞鑒定胚胎干細胞打靶，實際電壓為 256V，放電時間為 10ms，共獲得抗性克隆 190。通過抽提 96 孔板中胚胎干細胞的基因組 DNA 后，，進一步通過 PCR 篩選陽性隆，檢測到有 40 個正確同源重組克�。ㄒ妶D 1-3）。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R641

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