【摘要】：骨肉瘤(oseteosarcoma,OS)亦稱為成骨肉瘤,是一種常見于兒童和青少年的原發(fā)性惡性骨腫瘤。好發(fā)于長骨干骺端,尤其是近膝關(guān)節(jié)。總體發(fā)病率約4-5/100萬。盡管新輔助化療聯(lián)合手術(shù)綜合治療,已經(jīng)顯著提高了患者的5年生存率[1-6];但是,OS的總體治療效果仍較差,患者的長期無瘤生存率仍然很低(小于50%)[5]。早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,尤其是廣泛的肺轉(zhuǎn)移是造成骨肉瘤患者死亡的重要原因之一。因此,深入研究骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展過程中相關(guān)基因的表達(dá)對腫瘤的發(fā)生、演變、轉(zhuǎn)歸及治療具有重要意義,這也為骨肉瘤的早期診斷和治療提供了新的方法和途徑。1998年,Kitada等首先報道了常染色體隱性遺傳性青少年型帕金森綜合征(autosomal recessive juvenile parkinsonism,AR-JP)的致病基因,并將其命名為Parkin[7]。Parkin基因又叫PARK2基因,其廣泛存在于人與嚙齒動物的各種組織中。PARK2基因的異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展存在相關(guān)性。研究顯示:約有30%左右的惡性腫瘤發(fā)生了PAR 2基因的表達(dá)缺失或下調(diào)[8],包括腦膠質(zhì)瘤、肺癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等[9-14],提示PARK2可能是一個重要的抑癌基因。PARK2基因通過多種信號轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期、增殖、侵襲和遷移能力,以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)前尚無有關(guān)骨肉瘤中PARK2基因在骨肉瘤組織中的表達(dá)及其對骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為影響和可能機制研究的相關(guān)報道�；谝陨显�,本研究擬通過明確PARK2基因在骨肉瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá),并以此為依據(jù),進(jìn)一步構(gòu)建PARK2基因穩(wěn)定過表達(dá)的骨肉瘤細(xì)胞系。通過體外實驗深入探討PARK2基因?qū)侨饬黾?xì)胞增殖、生長周期、細(xì)胞遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響,并探索可能的信號通路調(diào)控機制;通過體內(nèi)模型進(jìn)一步驗證PARK2基因?qū)侨饬錾L的影響,以期為骨肉瘤的診斷與治療提供更多理論依據(jù)。本研究共分為以下3個部分:(1)PARK2在人骨肉瘤組織標(biāo)本和細(xì)胞系中的表達(dá)情況;(2)通過體外、體內(nèi)實驗探索PAPK2基因?qū)θ斯侨饬黾?xì)胞生物學(xué)行為的影響;(3)探索PARK2基因調(diào)控人骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的可能機制。第一章PARK2在人骨肉瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況目的:探索PARK2蛋白在骨肉瘤和癌旁組織,以及人骨肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá)情況。方法:收集和篩選人骨肉瘤組織和對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本,進(jìn)行PARK2蛋白的免疫組織化學(xué)染色,觀察PARK2蛋白在人骨肉瘤和癌旁組織中的表達(dá),通過免疫組化評分法對每一個樣本進(jìn)行綜合評分,分析PARK2在骨肉瘤與癌旁組織中的表達(dá)差異;以及PARK2的表達(dá)與患者年齡、發(fā)病部位、臨床分期之間的關(guān)系。選擇3種人骨肉瘤細(xì)胞系(SAOS2、HOS、U20S)和人成骨細(xì)胞hFOB1.19,通過RT-qPCR法檢測PARK2基因mRNA表達(dá)水平,對其結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析,揭示正常成骨細(xì)胞與人骨肉瘤細(xì)胞系中PARK2基因的表達(dá)差異,為過表達(dá)細(xì)胞系的選擇提供依據(jù)。結(jié)果:通過免疫組織化學(xué)法染色及評分,PARK2在人骨肉瘤標(biāo)本中陽性表達(dá)率為37%(17/46例);在匹配癌旁組織中陽性表達(dá)為76%(35/46例)(P0.05)。PARK2蛋白的表達(dá)與骨肉瘤的臨床分期成負(fù)相關(guān)。在3個骨肉瘤細(xì)胞系中PARK2基因的mRNA水平均顯著低于其在人成骨細(xì)胞hFOB1.19細(xì)胞中的表達(dá)(P0.05)。結(jié)論:在骨肉瘤中,PARK2基因呈普遍低表達(dá),提示PARK2基因的低表達(dá)可能與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。第二章PARK2對人骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響目的:研究目的基因PARK2對人骨肉瘤細(xì)胞增殖、生長周期、遷移、侵襲和誘導(dǎo)凋亡能力的影響。方法:選擇人骨肉瘤細(xì)胞HOS和U2細(xì)胞系,通過慢病毒載體構(gòu)建PARK2表達(dá)細(xì)胞系(PARK2組)和空載體細(xì)胞系(NC組)。通過免疫熒光和Western blot法檢測慢病毒載體對人骨肉瘤細(xì)胞PARK2基因的過表達(dá)效果。本研究以穩(wěn)定過表達(dá)PARK2細(xì)胞(PARK2組)和空載體細(xì)胞(NC組)為研究對象。1)通過CCK8、平板克隆形成和ki67熒光染色的方法檢測PARK2基因?qū)θ斯侨饬黾?xì)胞增殖能力的影響;利用流式檢測法分析PARK2基因?qū)θ斯侨饬黾?xì)胞周期的影響。2)通過劃痕實驗、Transwell小室遷移實驗和Transwell小室侵襲實驗研究PARK2基因?qū)θ斯侨饬黾?xì)胞遷移、侵襲能力的影響。3)利用Hoechst細(xì)胞核熒光染色,和流式細(xì)胞儀annexinV-APC/7-AAD雙染色法檢測PARK2基因?qū)θ斯侨饬黾?xì)胞凋亡的影響;通過Western blot分析PARK2基因?qū)Φ蛲鱿嚓P(guān)蛋白表達(dá)的影響。4)20只BALB/cnu/nu裸鼠被用于體內(nèi)實驗,選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HOS-PARK2和HOS-NC細(xì)胞經(jīng)脛骨原位種植成瘤(n=10)和經(jīng)尾靜脈注射模擬轉(zhuǎn)移瘤形成模型(n=10),進(jìn)一步驗證PARK2基因在體內(nèi)對人骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。結(jié)果:HOS和U20S細(xì)胞系穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PARK2基因和空載體后,Western blot檢測PARK2組Parkin蛋白表達(dá)量顯著增強;蛋白免疫熒光檢測PARK2組細(xì)胞熒光強度明顯高于NC組。兩組細(xì)胞的生物學(xué)功能分析如下:1)通過HOS和U20S兩個細(xì)胞系的生長曲線分析可知,與NC組細(xì)胞相比,PARK2組細(xì)胞增殖速度顯著減緩,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);在克隆形成實驗中,與對照組相比,PARK2組細(xì)胞克隆數(shù)及大小明顯減少,對50及50個以上的克隆細(xì)胞團統(tǒng)計分析,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);Ki67免疫熒光染色顯示,PARK2組細(xì)胞熒光表達(dá)強度明顯弱于NC組,計數(shù)分析發(fā)現(xiàn),較對照組相比,PARK2組細(xì)胞增殖特異性蛋白(ki67)的陽性表達(dá)顯著下降(P0.05)。流式細(xì)胞周期檢測,在HOS細(xì)胞系中,與NC組細(xì)胞相比,PARK2組細(xì)胞進(jìn)入S期和G2期的細(xì)胞比率明顯下降(P0.05)。2)細(xì)胞劃痕實驗和Transwell遷移、侵襲實驗顯示:較對照組細(xì)胞,PARK2組細(xì)胞遷移、侵襲能力明顯降低(P0.05)。3)Hoechst細(xì)胞核染色可見,PARK2組核異常細(xì)胞比率較對照組明顯增多(P0.05);流式細(xì)胞儀annexinV-APC/7-AAD雙染計數(shù)分析,PARK2組細(xì)胞凋亡率顯著高于NC組細(xì)胞(P0.05);Western blot檢測,較對照組相比,PARK2組細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減弱,凋亡蛋白caspase3表達(dá)增強,尤其是激活狀態(tài)的凋亡蛋白cleaved caspase 3表達(dá)明顯上調(diào)。4)裸鼠脛骨原位成瘤模型顯示:3周后,PARK2組脛骨腫瘤體積較NC組瘤體積更小(P0.05),HE染色發(fā)現(xiàn)在骨反應(yīng)區(qū)域可見血細(xì)胞及血管官腔樣結(jié)構(gòu),與對照組相比,PARK2組明顯減少;尾靜脈肺內(nèi)轉(zhuǎn)移模型顯示:PARK2組裸鼠肺內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤灶明顯少于對照組(P0.05),且轉(zhuǎn)移瘤體積也較對照組小。結(jié)論:PARK2基因可以影響人骨肉瘤細(xì)胞的生長周期,同時減弱細(xì)胞的增殖能力,抑制人骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,從而延緩骨肉瘤在體內(nèi)的生長和減少轉(zhuǎn)移的發(fā)生;其可能是通過抑制新生血管形成來抑制完成上述生物學(xué)行為的。第三章PARK2調(diào)控人骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的可能機制目的:探索PARK2基因?qū)ρ芟嚓P(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路JAK2/STAT3/VEGF的影響。方法:選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的PARK2組和NC組細(xì)胞。通過Western blot和蛋白免疫熒光法檢測兩組細(xì)胞JAK2/STAT3/VEGF通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況;加用通路相關(guān)激活劑(IL-6)和抑制劑(stattic)激活或抑制該通路后,體外觀察細(xì)胞小管形成能力和相應(yīng)蛋白的表達(dá)變化情況;5只BALB/cnu/nu裸鼠被用于體內(nèi)成血管模型,取相同數(shù)量的HOS-NC細(xì)胞和HOS-PARK2細(xì)胞分別種植于裸鼠的左側(cè)和右側(cè)腹股溝區(qū),加以驗證PARK2基因?qū)θ斯侨饬鲂律苄纬傻挠绊�。結(jié)果:Western blot法檢測發(fā)現(xiàn):與對照組相比,PARK2組p-JAK2、p-STAT3和VEGF蛋白表達(dá)顯著下降。蛋白免疫熒光檢測可見PARK2組細(xì)胞磷酸化STAT3和VEGF蛋白的熒光表達(dá)強度較NC組弱,且p-STAT3細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)明顯減少。體外小管形成實驗顯示:PARK2組細(xì)胞小管形成能力較對照組下降,IL-6和stattic可以顯著激活或抑制骨肉瘤細(xì)胞的小管形成能力和調(diào)節(jié)p-JAK2、p-STAT3、VEGF蛋白的表達(dá)。體內(nèi)新生血管形成實驗可見腹股溝血管與骨肉瘤細(xì)胞-基質(zhì)膠體連通,可見基質(zhì)膠體內(nèi)血管分布;與對照組相比,PARK2組基質(zhì)膠體內(nèi)血管分布較少,兩組血紅蛋白定量分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;基質(zhì)膠體切片、免疫熒光分析顯示:單個視野范圍內(nèi)PARK2組中CD34陽性表達(dá)率較對照組少。結(jié)論:PARK2基因通過JAK2/STAT3/VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制人骨肉瘤血管形成,進(jìn)而下調(diào)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)功能。
【圖文】：

ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｃａｓｅｓ邋ｃｏｍｐａｒｉｎｇ邋ＯＳ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ａｎｄ邋ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｎｏｎ－ｔｕｍｏｒ邋ｔｉｓｓｕｅｓ逡逑ｄｅｔｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．逡逑表２．邋１邋ＰＡＲＫ２在骨肉瘤及癌旁組織中的表達(dá)。ＰＡＲＫ２邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ逡逑ａｎｄ邋ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅ．逡逑Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ邋Ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｎｏｎ－ｔｕｍｏｒ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ逡逑—邐１１邐２９逡逑＋邐７邐６逡逑＋＋邐１０邐８逡逑＋＋＋邐１８邐３逡逑ＰＡＲＫ２免疫組化染色表達(dá)強度：－陰性，＋弱陽性，＋＋中度陽性，，＋＋＋強陽性。逡逑ＰＡＲＫ２在骨肉瘤中的表達(dá)與臨床之間的關(guān)系分析顯示：ＰＡＲＫ２蛋白在骨肉瘤組逡逑織中的表達(dá)與患者的年齡、性別、臨床病理分級和腫瘤體積間差異無統(tǒng)計學(xué)意義逡逑

為研究ＦｆＯ基因在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)行為，通過ＲＴ－ｑＰＣＲ法檢測逡逑ｍＲＮＡ在正常成骨細(xì)胞系ｈＦＯＢｌ．邋１９及人骨肉瘤細(xì)胞系ＳＡ０Ｓ２、Ｈ０Ｓ和Ｕ２０Ｓ逡逑中的表達(dá)。結(jié)果如圖２．２所示，與１＾（？１．１９相比，／＾尤？１１１１？脫在人骨肉瘤細(xì)胞逡逑系ＳＡＯＳ２、Ｈ０Ｓ和Ｕ２０Ｓ中的表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｋ０．０５，表２．邋３）。逡逑以Ｈ０Ｓ和Ｕ２０Ｓ骨肉瘤細(xì)胞系下降相對更為顯著。逡逑１６逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R738.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Activation of STAT3 signaling in human stomach adenocarcinoma drug-resistant cell line and its relationship with expression of vascular endothelial growth factor[J];World Journal of Gastroenterology;2005年06期

本文編號：2634677