【摘要】：研究目的:探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在含IKVAV兩親性肽凝膠生長(zhǎng)情況及凝膠誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化情況。研究方法:1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)全骨髓貼壁分離、培養(yǎng),倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CD29抗原、CD34抗原、CD45抗原、CD90抗原;細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化后在顯微鏡下觀察細(xì)胞向成脂、成軟骨方向分化情況。2、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組IKVAV(異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸)及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組EQS(谷氨酸-谷氨酰胺-絲氨酸)兩親性肽;將10mg/m L含IKVAV兩親性肽溶液加入等體積DMEM/F12數(shù)秒后自組裝成三維凝膠,進(jìn)行透射電鏡顯微鏡(TEM)觀察三維凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)。IKVAV兩親性肽凝膠與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的復(fù)合性培養(yǎng),經(jīng)活死細(xì)胞檢測(cè)試劑Calcein-AM/PI雙標(biāo)染色,在熒光顯微鏡觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在IKVAV兩親性肽凝膠內(nèi)存活情況。1×10~6 cells/m L骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液與零界點(diǎn)凝膠進(jìn)行混合形成凝膠(三維培養(yǎng)體系)及1×10~6cells/m L骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液接種于兩親性肽凝膠包被的蓋波片表面(二維培養(yǎng)體系),在完全培養(yǎng)基下培養(yǎng),經(jīng)CCK-8法檢測(cè)IKVAV兩親性肽凝膠對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)增殖/毒性作用。3、含細(xì)胞的培養(yǎng)液與多肽溶液混合后發(fā)生自組裝形成三維培養(yǎng)體系,實(shí)驗(yàn)分成3組:A組:單純骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)(空白對(duì)照組);B組:EQS凝膠與細(xì)胞共同培養(yǎng)形成的三維培養(yǎng)體系(實(shí)驗(yàn)對(duì)照組);C組:IKVAV凝膠與細(xì)胞共同培養(yǎng)形成的三維培養(yǎng)體系(實(shí)驗(yàn)組)。運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中MAP-2蛋白、GFAP蛋白、NSE蛋白表達(dá)水平;運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中GFAP蛋白,NSE蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1、倒置顯微鏡觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,呈漩渦狀態(tài)排列;原三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),結(jié)果顯示骨髓間充質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)CD29抗原和CD90抗原,不表達(dá)或者低表達(dá)CD34抗原和CD45抗原;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)25天后出現(xiàn)脂滴,經(jīng)油紅O染色后變成紅色;經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)24天后,進(jìn)行阿利辛藍(lán)染色后可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)酸性粘多糖染成淺綠色。2、實(shí)驗(yàn)組IKVAV(谷氨酸-谷氨酰胺-絲氨酸)肽設(shè)計(jì)序列:C_(16)H_(31)OA_3G_4D_2-IKVAV;對(duì)照組EQS(谷氨酸-谷氨酰胺-絲氨酸)肽設(shè)計(jì)序列:C_(16)H_(31)OA_3G_4D_2-EQS。電子顯微鏡顯示IKVAV兩親性肽凝膠由多維納米纖維構(gòu)成,納米纖維直徑3~6nm,長(zhǎng)度50~500 nm;質(zhì)譜測(cè)得合成IKVAV兩親性肽分子量為1438.71,與其理論值一致;HPLC分析IKVAV兩親性肽純度為95.74%;Calcein-AM/PI雙標(biāo)染色顯示:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與凝膠復(fù)合培養(yǎng)1天,3天,5天后,用Calcein-AM/PI(活死細(xì)胞染色)對(duì)培養(yǎng)1天,3天,5天分別進(jìn)行染色,在熒光顯微鏡下對(duì)活死細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),結(jié)果可發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的增加,活細(xì)胞的數(shù)目明顯增加,然后其死亡細(xì)胞未見(jiàn)明顯變化。CCK酶標(biāo)顯示:凝膠與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)形成的三維體系中細(xì)胞的增殖活力高于凝膠與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)形成的二維體系。3、采用Western-Blot方法檢測(cè)A組、B組、C組中目的蛋白的相對(duì)含量,使用單因素方差分析,結(jié)果顯示:C組中的NSE蛋白、MAP-2蛋白、GFAP蛋白表達(dá)量要遠(yuǎn)高于A組及B組,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,三組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。熒光雙標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞中表達(dá)NSE蛋白的細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光,表達(dá)GFAP蛋白的細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。在C組中檢測(cè)出表達(dá)NSE蛋白的紅色熒光大約占50%,表達(dá)GFAP蛋白的綠色熒光占約30%,而A組,B組中檢測(cè)到GFAP蛋白和NSE蛋白的表達(dá)水平低下。C組中NSE蛋白、GFAP蛋白表達(dá)水平明顯高于A組、B組,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:兩親性肽自組裝凝膠具有誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向分化。
【圖文】：

圖 1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代及傳代培養(yǎng)的細(xì)胞A、B：原代第 6 天的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（A×4、B×10）；C、D：第 2 代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（C×4、D×10）； E、F：第 3 代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（E×4、F×10）

17圖 2：表達(dá) CD29 抗原(陽(yáng)性率為 99.88%)，表達(dá) CD90 抗原(陽(yáng)性率為 99.88%)，表達(dá) CD34 抗原（陽(yáng)性率 1.64%），，表達(dá) CD45 抗原(陽(yáng)性率為 1.59%)。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R651.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2628984