【摘要】：背景椎間盤退變是腰痛的主要病因,據(jù)統(tǒng)計在人群中有較高患病率,嚴(yán)重情況下會導(dǎo)致殘疾,給患者帶來沉重的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。椎間盤是人體最大的無血管組織,由髓核,纖維環(huán)和軟骨終板組成。椎間盤內(nèi)氧濃度范圍為(1%O_(2-)5%O_2),在椎間盤退變后可能使得氧濃度范圍變得更低。干細(xì)胞存在于退變的髓核內(nèi),仍具有再生、分化能力等。然而在椎間盤退變的過程中內(nèi)源性髓核間充質(zhì)干細(xì)胞(nucleus pulposusmesenchymal stem cells,NPMSCs)為何保存“靜默”狀態(tài),不向類髓核細(xì)胞分化修復(fù)退變組織,仍需深入研究。目的分離培養(yǎng)髓核來源的間充質(zhì)干細(xì)胞,比較不同氧濃度下細(xì)胞的生物學(xué)特性(形態(tài)、干性、增殖能力、線粒體等相關(guān)基因的表達(dá)),探索氧濃度對椎間盤退變機(jī)制的影響。方法用膠原酶消化法從腰椎骨折(外傷性)及先天性脊柱側(cè)凸矯形患者手術(shù)摘除的4個腰椎間盤(Pfirrmann椎間盤退變分級為Ⅰ級或Ⅱ級)髓核組織中分離細(xì)胞,體外培養(yǎng),傳代,觀察記錄細(xì)胞形態(tài)。取P3代細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀對分離得到的細(xì)胞表面抗原CD90、CD73、CD105、CD44和CD31、CD34、CD45的表達(dá)情況進(jìn)行檢測;用成骨、成脂A、成脂B、成軟骨培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞,分別在21d、28d、21d用茜素紅、油紅O、甲苯胺藍(lán)對細(xì)胞進(jìn)行染色,觀察其成骨、成脂、成軟骨能力�；趪H干細(xì)胞治療協(xié)會(ISCT)有關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的判定標(biāo)準(zhǔn),對本實(shí)驗得到的細(xì)胞進(jìn)行綜合評估鑒定。在三氣培養(yǎng)箱的低氧條件(2%O_2、5%CO_2、37°C),常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)箱的常氧條件(20%O_2、5%CO_2、37°C)下培養(yǎng)P3代細(xì)胞。通過細(xì)胞計數(shù)計算各時間點(diǎn)(1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d)細(xì)胞的數(shù)量,比較不同氧濃度的生長曲線。使用Architect c8000自動生化檢測儀檢測各時間點(diǎn)(1d、2d、3d、4d、5d)培養(yǎng)基的PH值、滲透壓。實(shí)時熒光定量(qRT-PCR)檢測不同氧濃度培養(yǎng)下細(xì)胞的干性基因POU5F1(OCT4)、NANOG、SOX2及擴(kuò)增基因CCND1(CyclinD1)、MYC(c-Myc)、低氧誘導(dǎo)基因EPAS1(HIF1α)、能量基因ATP5A1、線粒體相關(guān)基因COX4I1、TFAM、MT-CO_(1、)MT-CO_2的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果髓核來源的間充質(zhì)干細(xì)胞呈典型的單層貼壁生長,紡錘樣。P3代細(xì)胞免疫表型鑒定顯示MSCs表面分子標(biāo)記高表達(dá)CD90(80.4%)、CD73(99.9%)、CD105(99.8%)、CD44(95.9%),低表達(dá)CD31(5.3%)、CD34(4.4%)、CD45(6.8%)。茜素紅、油紅O染色、甲苯胺藍(lán)染色證實(shí)可向骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分化。根據(jù)ISCT有關(guān)MSCs的判定標(biāo)準(zhǔn),分離培養(yǎng)的細(xì)胞即NPMSCs。低氧環(huán)境下細(xì)胞形態(tài)更小,形態(tài)更接近原始間充質(zhì)干細(xì)胞。細(xì)胞增殖更快,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),低氧時倍增期為31.22±1.98 h,常氧時倍增期為39.56±2.02 h。不同氧濃度各時間點(diǎn)培養(yǎng)基的PH值、滲透壓差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),且皆處于適于細(xì)胞生成的范圍。低氧培養(yǎng)細(xì)胞干性基因POU5F1(OCT4)、NANOG、SOX2較常氧培養(yǎng)顯著升高(P0.05);擴(kuò)增基因CCND1(CyclinD1)、MYC(c-Myc)較常氧顯著升高(P0.05);低氧誘導(dǎo)因子HIF1α相關(guān)基因EPAS1顯著升高(P0.05);核編碼的能量基因ATP5A1(三磷酸腺苷合成酶)低氧時顯著升高(P0.05);核編碼的與線粒體合成等功能有關(guān)基因COX4I1(細(xì)胞色素c氧化酶IV亞基1型同工酶)、TFAM(線粒體轉(zhuǎn)錄因子A)低氧時明顯降低(P0.05);線粒體編碼的與自身生成、合成功能相關(guān)基因MT-CO_1(線粒體編碼細(xì)胞色素c氧化酶I)、MT-CO_2(線粒體編碼細(xì)胞色素c氧化酶II)低氧時明顯降低(P0.05)。結(jié)論低氧環(huán)境下人NPMSCs的形態(tài)更小、擴(kuò)增能力更強(qiáng)、PH值、滲透壓無明顯影響,但促進(jìn)干性、擴(kuò)增、低氧誘導(dǎo)基因及合成能量基因的表達(dá),抑制線粒體合成功能相關(guān)基因的表達(dá)。
【圖文】：

均一的短紡錘形，而 P1 代細(xì)胞大小較 P0顯提早，約 5-7d 細(xì)胞即可融合至傳代，致，為紡錘樣梭形，一般約 3-4 天細(xì)胞即消化傳代。由于 P3 代細(xì)胞形態(tài)大小、增可滿足使用，故本實(shí)驗選取 P3 代細(xì)胞進(jìn)

圖 1：正常髓核間充質(zhì)干細(xì)胞（NPMSCs）:光鏡下 P3 代細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)均一，，呈紡錘樣梭形（×4）。Figure 1: The third passage cultured NPMSCs from non -degenerative nucleuspulposus generally grew into typical, adherent monolayer cells,with a fibroblast-likeappearance（×4）。2.2 表面抗原表達(dá)使用流式細(xì)胞儀檢測成功分離的人髓核間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞表面標(biāo)志，高表達(dá) CD90(80.4%)、CD73(99.9%)、CD105(99.8%)、CD44（95.9%），低表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志 CD31(5.3%)、CD34(4.4%)、CD45（6.8%）（圖 2）。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R681.5

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本文編號：2625736