發(fā)布時間：2020-04-09 01:07

【摘要】：惡性腫瘤早期轉(zhuǎn)移并對化療藥物耐受是導(dǎo)致腫瘤患者治療失敗的重要原因,然而目前常用的廣譜性抗腫瘤藥物缺乏對相關(guān)耐藥基因的抑制功能,單純加大藥物劑量不但沒有提高療效反而引起了嚴重的副反應(yīng),目前臨床急需探明與耐藥相關(guān)的基因,并尋找有效的靶向調(diào)控藥物。近年來通過臨床對不同分期的腫瘤組織進行基因及蛋白差異性表達的篩查證實高惡性度的多種腫瘤中,包括前列腺癌、膀胱癌、小細胞肺癌以及惡性膠質(zhì)瘤等均有分化抑制因子(inhibitior of differentation,Id)的異常高表達,進一步研究也表明Id家族中的Id1對腫瘤的發(fā)生發(fā)展、耐藥以及轉(zhuǎn)移過程均具有重要的研究價值�，F(xiàn)認為,一方面高表達Id1會促使腫瘤細胞形成轉(zhuǎn)移,Hao等人的研究就提出患有高表達Id1的骨肉瘤患者組較低表達Id1組更容易出現(xiàn)對周圍組織的侵犯與轉(zhuǎn)移,最終引起死亡率上升;Chen等人對小細胞肺癌的研究中也有類似觀點,他們證實高惡性度的N417細胞系較良性細胞系Beas-2B表達更多的Id1,且與腫瘤的轉(zhuǎn)移聯(lián)系緊密,而有效敲除Id1不但降低了腫瘤的增殖,還下調(diào)了血管生成有關(guān)的VEGF分子表達。另一方面,越來越多證據(jù)顯示腫瘤細胞中持續(xù)表達Id1對腫瘤在化療藥物治療下存活的重要性:1、抑制Id1表達不但減少了腫瘤發(fā)生耐藥性的可能,而且研究表明抑制Id1異常高表達能夠有效抑制腫瘤組織的大小,并且提高化療藥物如多柔比星、順鉑等效果。Cheng等人對小細胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn):雖然Id1高表達的腫瘤體積往往較Id1陰性組更大,但Id1高表達組化療后如果能抑制Id1的表達,殺傷腫瘤效果往往比Id1陰性組更明顯,進而明顯延長無病生存時間和總生存率,因此近年學(xué)者提出Id1可作為針對腫瘤靶向治療重要的靶點,借由消除異常表達Id1消除相關(guān)腫瘤的活性與耐藥性。骨肉瘤是目前骨科最常見的惡性腫瘤,一方面其好發(fā)于肱骨近端、脛骨干骺端以及股骨,影響患肢功能和預(yù)后。目前單純手術(shù)切除病灶療效不理想,資料顯示不進行輔助化療的患者局部復(fù)發(fā)以及遠處轉(zhuǎn)移發(fā)生幾率明顯增高,且5年生存率不到20%[1]。臨床研究以及指南推薦順鉑、阿霉素、環(huán)磷酰胺作為骨肉瘤的一線化療藥物[2],且20世紀70年代輔助化療應(yīng)用于治療骨肉瘤后,有效的化療輔助下患者5年生存率可提高至60%～70%[2],故有效的輔助化療是預(yù)防保肢患者復(fù)發(fā)的主要手段。另一方面,骨肉瘤高發(fā)于青少年和老年人,需要減少用藥劑量以避免大劑量的化療藥物引起的毒副反應(yīng),但骨肉瘤耐藥性導(dǎo)致部分患者腫瘤復(fù)發(fā)并影響生存率的現(xiàn)象近年來并沒有得到進一步改善[3]。因此減少骨肉瘤耐藥的發(fā)生、提高患者預(yù)后是目前臨床工作的重點。骨肉瘤作為分化異常的成骨細胞,分化抑制因子1(Id1)異常高表達在腫瘤中發(fā)揮重要功能。已有研究證實骨肉瘤高表達Id1[4],且Enneking分級越高的骨肉瘤中這種異常越明顯,說明Id1與腫瘤惡性程度間的關(guān)聯(lián)。此外,Id1 是骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)信號通路下游重要的信號靶點,通過對目的靶基因轉(zhuǎn)錄以及相關(guān)蛋白的調(diào)控作用在骨肉瘤細胞中發(fā)揮重要功能[5]。研究證實Id1在多種疾病中存在核轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,并通過介導(dǎo)與細胞存活、增殖、遷移以及耐藥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮功能[6]。因此,有效抑制Id1這種負性調(diào)控基因參與轉(zhuǎn)錄能有效抑制Id1相關(guān)耐藥性的產(chǎn)生,從而提高患者的化療效果[7]。目前研究顯示,包括順鉑在內(nèi)的多種化療藥物均不能抑制多種腫瘤中高表達的Id1,且研究顯示Id1表達能夠介導(dǎo)腫瘤細胞對順鉑等化療藥物耐藥性的產(chǎn)生,導(dǎo)致化療失敗[8]。課題組成員早在2004年一項報道中就闡述了 Id基因家族對骨分化的重要性,在成骨干細胞早期表達Id1有利于細胞增殖,敲除Id1的表達會影響B(tài)MPs尤其是BMP9的成骨作用,而近年我們進一步探索發(fā)現(xiàn)骨細胞成熟異常引起的成瘤現(xiàn)象是導(dǎo)致骨肉瘤發(fā)生的重要原因。本校的另一項研究項目也證實了 Id基因在間充質(zhì)干細胞成骨分化異常中的作用,均揭示了抑制Id1異常對骨肉瘤成骨分化的積極意義。雖然目前普遍認可Id1的表達異常貫穿多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的整個病理過程,但仍對Id1蛋白在腫瘤細胞中異常表達的原因及具體作用機制仍不完全明確。一、骨肉瘤高表達Id1并介導(dǎo)對順鉑耐藥性的產(chǎn)生目的分析分化抑制因子1(inhibitor of differentiation 1,Id1)在骨肉瘤患者與正常人(骨關(guān)節(jié)炎患者)的表達水平差異,明確臨床切除組織中Id1在骨肉瘤中高表達;探討順鉑對3種骨肉瘤細胞MG63,143b以及HOS中Id1表達的作用,探討沉默Id1基因?qū)侨饬鲰樸K耐藥性的影響。方法1.收集12例骨肉瘤患者的石蠟切片以及12例骨關(guān)節(jié)炎全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后骨組織切片,通過免疫組化分析兩組間Id1表達差異。2.利用順鉑處理MG63、143b以及HOS細胞株,通過Western blot技術(shù)檢測Id1表達水平的變化;3.免疫熒光技術(shù)分析Id1在順鉑作用的核位移現(xiàn)象;4.構(gòu)建Id1穩(wěn)定沉默的MG63-Id1、143b-Id1以及HOS-Id1,采用CCK-8以及流式細胞學(xué)技術(shù)分析Id1對骨肉瘤細胞株抗凋亡作用的影響。結(jié)果1.免疫組化結(jié)果提示Id1在骨肉瘤組織中表達明顯高于對照組;Id1在轉(zhuǎn)移灶中腫瘤組織與周圍間質(zhì)成明顯差異。2.高濃度順鉑介導(dǎo)3種骨肉瘤細胞株表達Id1;3.免疫熒光提示順鉑介導(dǎo)骨肉瘤細胞中Id1的核轉(zhuǎn)移;4.免疫熒光提示順鉑介導(dǎo)了骨肉瘤中Id1與p65在核內(nèi)的交聯(lián)。5.Id1穩(wěn)定敲低組對順鉑敏感性明顯升高。結(jié)論骨肉瘤患者病變組織表達高水平的Id1,這種改變具有較高的組織特異性,因此針對Id1表達的藥物可能具有較高的腫瘤組織特異性而避免影響其他正常的組織,具有一定的臨床意義。同時,敲除Id1組對順鉑的敏感性提高(細胞活性以及凋亡程度上具有明顯差異,P0.05),證實了抑制Id1對治療骨肉瘤的積極作用。但Id1不僅不能夠被順鉑有效的抑制,且骨肉瘤組織表達的Id1通過核轉(zhuǎn)移,并通過與p65交聯(lián)參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄參與了腫瘤細胞株對順鉑的耐藥作用,因此尋找能有效抑制Id1的化療藥物提高順鉑作用是迫切的。二、辣椒堿通過NF-kB以及TGF信號通路抑制骨肉瘤細胞株表達Id1目的研究辣椒堿能否有效的抑制骨肉瘤中Id1的表達,并探討其作用方式以及信號通路,為后續(xù)聯(lián)合順鉑治療骨肉瘤提供基礎(chǔ)。方法1.通過不同濃度(0-250umol/L)辣椒堿單獨作用于MG63、143b以及HOS細胞株,以及不同時間下,收集細胞。2.通過Western Blot以及qPCR闡明其抑制Id1的作用方式。3.利用Western Blot探討辣椒堿抑制Id1的可能途徑。4.加用NF-kB以及TGF家族信號抑制劑證實上訴通路與辣椒堿作用于Id1的關(guān)系,分析Id1與這些通路間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果1.辣椒堿能夠有效抑制腫瘤細胞中Id1的蛋白表達,同時介導(dǎo)腫瘤細胞中mRNA的擴增。2.信號通路抑制劑提示NF-kB家族中p65的活化會介導(dǎo)Id1蛋白的穩(wěn)定性,而辣椒堿介導(dǎo)TGF下游Smad2蛋白的磷酸化是辣椒堿提高Id1的重要因素;結(jié)論辣椒堿能夠通過濃度以及時間依賴的方式抑制骨肉瘤細胞株中Id1蛋白穩(wěn)定性并提高Id1的轉(zhuǎn)錄水平。辣椒堿抑制Id1與抑制AKT-IKB-p65信號通路的磷酸化密切相關(guān)。辣椒堿提高Id1轉(zhuǎn)錄與TGF信號通路活化而非BMP信號通路活化密切相關(guān),說明骨肉瘤中Id1的表達不僅僅與Smad1/5有關(guān),證實了調(diào)控Id1的復(fù)雜性。加用上訴通路抑制劑后證實AKT-IKB-p65信號通路可以影響Id1的表達以及TGF家族信號傳導(dǎo),證實兩者在影響Id1上的密切關(guān)系,而辣椒堿通過改變上訴通路最終抑制了 Id1的蛋白。三、辣椒堿抑制順鉑介導(dǎo)的Id1表達及核轉(zhuǎn)移提高骨肉瘤對順鉑的敏感性目的研究體外實驗中通過聯(lián)合辣椒堿驗證其加強骨肉瘤的化療作用,并探討上訴辣椒堿抑制Id1相關(guān)信號通路在兩者聯(lián)合應(yīng)用中提高骨肉瘤對順鉑敏感性的作用。方法1.辣椒堿聯(lián)合順鉑應(yīng)用于骨肉瘤細胞株,應(yīng)用于MG63、143b以及HOS細胞株;利用CCK8實驗檢測細胞活性2.流式細胞學(xué)分析辣椒堿對順鉑引起凋亡作用影響3.Western blot分析兩者在Id1相關(guān)信號分子機制的差異。4.免疫熒光證實辣椒堿能有效抑制順鉑介導(dǎo)的Id1入核作用。結(jié)果1.聯(lián)合應(yīng)用下辣椒堿能明顯加強順鉑介導(dǎo)的細胞活性下降2.流式細胞學(xué)實驗證實辣椒堿能夠有效加強順鉑對辣椒堿的作用3.辣椒堿通過抑制順鉑引起的p65以及Smad1/5的磷酸化抑制腫瘤細胞表達Id14.免疫熒光提示聯(lián)合辣椒堿介導(dǎo)Id1環(huán)膜現(xiàn)象,結(jié)合核內(nèi)蛋白Western blot分析證實辣椒堿有效抑制順鉑引起的Id1入核現(xiàn)象。結(jié)論辣椒堿聯(lián)合順鉑能夠明顯加強對骨肉瘤的化療效果,進一步實驗證實辣椒堿能夠有效消除順鉑介導(dǎo)的NF-kB信號通路以及TGF家族信號通路的改變。上訴通路最終導(dǎo)致Id1的明顯下降。應(yīng)用辣椒堿后抑制了 Id1的入核現(xiàn)象,也暗示了對Id1作用的抑制。通過抑制蛋白量以及功能后削弱了 Id1對順鉑的耐藥作用,促進骨肉瘤細胞凋亡。
【圖文】：

２．３免疫熒光檢測應(yīng)用順yP后Ｉｄｌ表達部位逡逑根據(jù)免疫熒光提示靜止狀態(tài)下３種細胞株表達的Ｉｄｌ蛋白主要存在于細胞質(zhì)中，逡逑而當應(yīng)用一定劑量的順鉑后，骨肉瘤中Ｉｄｌ的核質(zhì)熒光比出現(xiàn)倒轉(zhuǎn)，結(jié)合圖２中Ｉｄｌ逡逑總量上升

根據(jù)免疫熒光提示靜止狀態(tài)下３種細胞株表達的Ｉｄｌ蛋白主要存在于細胞質(zhì)中，逡逑而當應(yīng)用一定劑量的順鉑后，骨肉瘤中Ｉｄｌ的核質(zhì)熒光比出現(xiàn)倒轉(zhuǎn)，結(jié)合圖２中Ｉｄｌ逡逑總量上升，提示順鉑能介導(dǎo)Ｉｄｌ的入核。詳見
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R738

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本文編號：2620075