【摘要】：第一部分 SCN9A基因錯(cuò)義突變導(dǎo)致先天性無痛癥——出人意料的基因型-表型關(guān)系背景:先天性無痛癥(Congenital Insensitivity to Pain,CIP)是一種極為罕見的常染色體隱性遺傳病,是由SCN9A基因突變導(dǎo)致其編碼的Nav1.7功能缺失所致。迄今為止,全球報(bào)道的CIP患者僅40余例,對(duì)于CIP患者基因型-臨床表型之間的復(fù)雜關(guān)系仍然不清。本課題組作為中國CIP的主要研究團(tuán)隊(duì),2009年至今,僅收集到4例中國CIP患者,并于2011年發(fā)表了中國唯一一篇關(guān)于CIP患者的研究報(bào)告�；诖�,本文重點(diǎn)研究中國僅有的3例未報(bào)道的CIP患者的基因型和表型關(guān)系。目的:篩查罕見病CIP中國患者的突變基因,研究基因型-表型之間的關(guān)系,探討其致病機(jī)制。方法:1.簽署患者、患者家屬的知情同意書;收集患者及其家系的疾病信息,并記錄患者、患者家屬的臨床表型(癥狀、影像學(xué)等);收集血樣,從全血中提取基因組DNA,通過基因芯片對(duì)患者進(jìn)行基因突變檢測(cè),檢測(cè)基因包括:SCN9A、SCN10A、SCN11A、NGF、NTRK1、PRDM12等60個(gè)與疼痛相關(guān)的基因。2.針對(duì)不同突變類型的基因,進(jìn)行生物信息學(xué)分析:針對(duì)SCN9A基因的移碼突變和突變所在區(qū)域、讀碼框,分析移碼突變對(duì)Nav1.7蛋白結(jié)構(gòu)的影響;針對(duì)SCN9A基因的內(nèi)含子突變和所在部位,分析內(nèi)含子突變對(duì)SCN9A基因剪接功能的影響;針對(duì)SCN9A基因的錯(cuò)義突變,利用Clustal Omega軟件分析突變所在區(qū)域氨基酸殘基的保守性,利用Polyphen2軟件和SIFT軟件預(yù)測(cè)錯(cuò)義突變對(duì)Nav1.7功能的影響。3.構(gòu)建SCN9A野生型和突變型載體,用載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,獲得能夠表達(dá)野生型或突變型Nav1.7的HEK293細(xì)胞。針對(duì)內(nèi)含子剪接區(qū)突變,進(jìn)行體外剪接驗(yàn)證,檢測(cè)內(nèi)含子突變對(duì)Nav1.7 mRNA剪接的影響;針對(duì)錯(cuò)義突變,通過全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn),確定錯(cuò)義突變對(duì)Nav1.7電生理功能的影響;通過逆轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)、Western Blotting和免疫熒光檢測(cè),確定錯(cuò)義突變對(duì)Nav1.7表達(dá)水平和亞細(xì)胞定位的影響。結(jié)果:1.3例CIP患者的主要臨床表型為:1)先天性無痛:患者對(duì)傷害性刺激(如打針抽血、損傷、燙傷等)均無疼痛表現(xiàn)和不愉快表情,且常常發(fā)生自殘,如咬傷舌頭、手指等行為;2)嗅覺缺失,不能區(qū)分水、酒精和白醋的氣味。2.3例CIP患者均為復(fù)合雜合突變,共檢測(cè)出6個(gè)未報(bào)道的SCN9A基因突變,且未檢測(cè)到其他基因突變。患者1攜帶復(fù)合雜合移碼突變:c.850delG(p.Glu284Lysfs*3)和c.129_141delTGAAGAAGCCCCA(p.Asp43Glufs*43);患者2攜帶復(fù)合雜合內(nèi)含子突變:c.4174-1GC(Intron 22)和c.4228-10AG(Intron23);患者3攜帶復(fù)合雜合錯(cuò)義突變:c.296GA(p.Arg99His)和c.2749TG(p.Trp917Gly)。3.生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn):患者1攜帶的SCN9A移碼突變c.850delG(p.Glu284Lysfs*3)和c.129_141delTGAAGAAGCCCCA(p.Asp43Glufs*43),分別位于Nav1.7蛋白domain I第一次跨膜區(qū)域和N端,導(dǎo)致Nav1.7蛋白在此處表達(dá)終止,產(chǎn)生截?cái)嘈蚇av1.7通道蛋白,進(jìn)而造成Nav1.7四個(gè)結(jié)構(gòu)域幾乎全部缺失�；颊�2攜帶的SCN9A內(nèi)含子突變c.4174-1GC和c.4228-10AG,分別位于Intron 22和Intron23剪接區(qū)域,會(huì)造成Nav1.7 mRNA的剪接異常�；颊�3攜帶SCN9A錯(cuò)義突變c.296GA(p.Arg99His)和c.2749TG(p.Trp917Gly),這兩個(gè)突變所在部位氨基酸殘基Arg99和Trp917分別位于Nav1.7蛋白N端和domain II離子孔道區(qū)域,通過多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),這兩個(gè)氨基酸殘基在生物進(jìn)化過程中、在人類鈉通道家族中高度保守;對(duì)Nav1.7錯(cuò)義突變的致病性預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,Nav1.7突變p.Arg99His和p.Trp917Gly具有很強(qiáng)的致病性,PolyPhen-2預(yù)測(cè)結(jié)果為:0.953和1.000(分值越高,越具有致病性)。4.對(duì)患者2的內(nèi)含子突變進(jìn)行體外功能驗(yàn)證發(fā)現(xiàn):內(nèi)含子突變c.4174-1GC和c.4228-10AG會(huì)導(dǎo)致Nav1.7 mRNA剪接異常,進(jìn)而產(chǎn)生截?cái)嘈蚇av1.7。5.對(duì)患者3的錯(cuò)義突變進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)發(fā)現(xiàn):與野生型Nav1.7通道相比,p.Arg99His突變型Nav1.7通道電流明顯減少,約為野生型的一半;p.Trp917Gly突變型Nav1.7通道電流幾乎消失。Nav1.7表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果顯示,p.Arg99His突變和p.Trp917Gly突變均不影響Nav1.7 mRNA表達(dá);p.Arg99His突變導(dǎo)致Nav1.7通道蛋白表達(dá)水平明顯下降,約為野生型的48%(P0.001),細(xì)胞膜Nav1.7表達(dá)水平也明顯下降,約為野生型的43%(P0.001),而p.Trp917Gly突變并沒有影響Nav1.7通道蛋白表達(dá)水平(P0.05)。結(jié)論:1.3例中國CIP患者的主要臨床表型是先天性無痛和嗅覺缺失,3例患者均攜帶復(fù)合雜合基因突變,共攜帶6個(gè)未報(bào)道的SCN9A基因突變,未發(fā)現(xiàn)其他基因突變。2.患者1的SCN9A基因移碼突變和患者2的SCN9A基因內(nèi)含子突變,最終均產(chǎn)生截?cái)嘈蚇av1.7。3.CIP患者3攜帶復(fù)合雜合SCN9A基因錯(cuò)義突變,c.296GA,p.Arg99His和c.2749TG,p.Trp917Gly。對(duì)患者3攜帶的2個(gè)錯(cuò)義突變進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CIP患者3的突變Nav1.7仍然保留了部分通道功能,但患者表現(xiàn)為無痛,這與之前研究結(jié)論“Nav1.7功能完全缺失導(dǎo)致無痛”截然不同,患者3這種出人意料的基因型-表型關(guān)系非常值得關(guān)注。4.對(duì)患者3攜帶的錯(cuò)義突變進(jìn)行電生理和表達(dá)水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),位于Nav1.7 N端的氨基酸殘基p.Arg99在維持Nav1.7表達(dá)和膜定位中發(fā)揮重要作用,位于Nav1.7離子孔道形成部位的氨基酸殘基p.Trp917在維持Nav1.7正常電生理功能中發(fā)揮重要作用,這將有助于Nav1.7靶向鎮(zhèn)痛藥物的開發(fā)。第二部分DRG內(nèi)Nav1.7表達(dá)在術(shù)后疼痛中的作用研究背景:急性術(shù)后疼痛會(huì)嚴(yán)重影響患者術(shù)后恢復(fù)和生活質(zhì)量,是目前臨床上亟待解決的一大難題,但其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。目前認(rèn)為,外周傷害性感受器興奮性增加是術(shù)后疼痛發(fā)生的重要機(jī)制,因此,從源頭上阻止疼痛信號(hào)向中樞的傳遞是預(yù)防和治療術(shù)后疼痛的關(guān)鍵。在疼痛信號(hào)的產(chǎn)生和傳導(dǎo)過程中,背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal Root Ganglion,DRG)是機(jī)體疼痛電信號(hào)向脊髓及以上中樞傳遞的紐帶,其中SCN9A基因編碼的鈉通道Nav1.7是介導(dǎo)DRG神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏淖钪饕ǖ�。Nav1.7通過決定動(dòng)作電位起始閾值調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性,進(jìn)而在疼痛信號(hào)的產(chǎn)生和傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。Nav1.7功能亢進(jìn)會(huì)引起傷害性感受器過度興奮,進(jìn)而導(dǎo)致紅斑肢痛癥、陣發(fā)性劇痛等疾病;Nav1.7功能缺失會(huì)引起傷害性感受器抑制,進(jìn)而導(dǎo)致先天性無痛癥。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),Nav1.7敲除小鼠不再發(fā)生神經(jīng)生長因子(Nerve Growth Factor,NGF)、弗氏完全佐劑(Complete Freund’s Adjuvant,CFA)等引發(fā)的急性炎性疼痛,Nav1.7抑制劑可抑制大鼠的急性炎性疼痛和急性刺激性疼痛。然而,目前關(guān)于Nav1.7在急性術(shù)后疼痛中的作用尚無研究。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),編碼Nav1.7的SCN9A基因多態(tài)性影響一般人群基礎(chǔ)疼痛敏感性和手術(shù)患者術(shù)后疼痛敏感性;CIP患者不僅對(duì)急性傷害性刺激(如打針、骨折等)表現(xiàn)為無痛,而且手術(shù)后也感覺不到疼痛。據(jù)此,我們推測(cè)DRG內(nèi)Nav1.7增加可能在術(shù)后疼痛中發(fā)揮重要作用,有必要進(jìn)一步對(duì)手術(shù)后DRG內(nèi)Nav1.7的表達(dá)和作用進(jìn)行深入研究。目的:檢測(cè)DRG內(nèi)Nav1.7通道蛋白在足底切口大鼠術(shù)后疼痛過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá),研究其表達(dá)在術(shù)后疼痛發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法:1.建立足底切口疼痛大鼠模型,分別在手術(shù)前和手術(shù)后2小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、120小時(shí)進(jìn)行疼痛的行為學(xué)檢測(cè):包括機(jī)械性疼痛縮爪閾值(Mechanical Withdrawal Threshold,MWT)、熱刺激縮爪潛伏期(Thermal Withdrawal Lantency,TWL)和累積疼痛評(píng)分,同時(shí)利用定量PCR(Quantitative Polymerase Chain Reaction,Q-PCR)和Western Blotting檢測(cè)大鼠DRG組織Nav1.7m RNA和蛋白的表達(dá)水平。2.將大鼠進(jìn)行鞘內(nèi)置管,根據(jù)利多卡因試驗(yàn)鑒定置管是否成功,置管成功者用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。大鼠隨機(jī)分為四組:空白對(duì)照(control)組、足底切口手術(shù)(incision)組、Nav1.7干擾慢病毒(SCN9A-RNAi-LV)+incision組、陰性對(duì)照慢病毒(NC-LV)+incision組。通過鞘內(nèi)注射SCN9A-RNAi-LV或NC-LV,3天后建立足底切口疼痛大鼠模型,分別在手術(shù)前和手術(shù)后2小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)進(jìn)行疼痛的行為學(xué)測(cè)定,包括機(jī)械性疼痛敏感性、熱痛敏感性和累積疼痛評(píng)分。由于在前期實(shí)驗(yàn)觀察到手術(shù)后2小時(shí),大鼠疼痛閾值最低,Nav1.7表達(dá)最高,因此本研究選擇手術(shù)后2小時(shí),通過Q-PCR檢測(cè)大鼠DRG內(nèi)Nav1.7 m RNA的表達(dá)水平,同時(shí)通過Western Blotting和免疫組化檢測(cè)大鼠DRG組織內(nèi)Nav1.7蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:1.足底切口大鼠手術(shù)后表現(xiàn)為MWT、TWL明顯下降,累積疼痛評(píng)分明顯增加(P0.05),同時(shí)大鼠DRG內(nèi)Nav1.7 m RNA和Nav1.7通道蛋白表達(dá)明顯增加(P0.05)。手術(shù)后2小時(shí),MWT和TWL下降最明顯,Nav1.7 m RNA和Nav1.7通道蛋白表達(dá)最高,隨后逐漸恢復(fù)。2.鞘內(nèi)注射SCN9A-RNAi-LV后,大鼠DRG內(nèi)Nav1.7 m RNA和蛋白表達(dá)明顯下降(P0.05),而不影響Nav1.8和Nav1.9表達(dá)(P0.05)。3.與incision組比較,SCN9A-RNAi-LV+incision組大鼠足底切口手術(shù)后DRG內(nèi)Nav1.7增加明顯下降(P0.05),MWT、TWL明顯升高,累積疼痛評(píng)分明顯降低(P0.05)。結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn),大鼠足底切口手術(shù)后,其MWT、TWL明顯下降,累積疼痛評(píng)分明顯增加,同時(shí)大鼠DRG內(nèi)Nav1.7 m RNA和Nav1.7通道蛋白表達(dá)明顯增加;而鞘內(nèi)注射SCN9A-RNAi-LV特異性下調(diào)大鼠DRG內(nèi)Nav1.7表達(dá),大鼠手術(shù)后MWT、TWL明顯升高,累積疼痛評(píng)分明顯降低,這表明DRG內(nèi)Nav1.7表達(dá)增加參與了術(shù)后疼痛的發(fā)生、發(fā)展。
【圖文】：

av1.7 通道蛋白 亞基二級(jí)結(jié)構(gòu)和已報(bào)道的與 CIP 相關(guān)的 SCN9A 基因突變位點(diǎn)所色實(shí)心方框代表產(chǎn)生截?cái)嘈?Nav1.7 的 SCN9A 基因突變，紅色實(shí)心圓代表 SCN9。綠色實(shí)心方框代表本研究中，患者 1 攜帶的兩個(gè) SCN9A 移碼突變，分別位于 N N-端和 domain I S5~S6 之間。綠色實(shí)心圓代表本研究中，患者 3 攜帶的兩個(gè) SC分別位于 Nav1.7 通道蛋白 N 端和 Nav1.7 通道蛋白 domain II 選擇性過濾孔道部位 2011 年中國第一例 CIP 患者報(bào)道至今[31]，本課題組共收集到 4 例 CIP本研究總結(jié)了另外 3 例 CIP 患者的臨床表型，并且進(jìn)行基因突變篩查，者 3 攜帶 SCN9A 錯(cuò)義突變，并對(duì)此做重點(diǎn)研究。為了解患者臨床表型

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論10 HEPES，0.1 CdCl2，20 TEA-Cl，0.001 TTX，10-30 Glucose，NaOH 調(diào)節(jié) PH 至 7.410 HEPES，1 EGTA，5 TEA-Cl，，4 Mg-ATP，CsOH 調(diào)節(jié) PH 至 7.脂糖凝膠電泳緩沖液配置（50 ×TAE 緩沖液）：se 242g，Na2EDTA 2H2O 37.2g，醋酸 57.1 mL，加入適量去離至 1L，使用時(shí)稀釋 50 倍即可。設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)如圖 2 所示：
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R614

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本文編號(hào)：2619685