【摘要】：第一部分 SCN9A基因錯義突變導致先天性無痛癥——出人意料的基因型-表型關系背景:先天性無痛癥(Congenital Insensitivity to Pain,CIP)是一種極為罕見的常染色體隱性遺傳病,是由SCN9A基因突變導致其編碼的Nav1.7功能缺失所致。迄今為止,全球報道的CIP患者僅40余例,對于CIP患者基因型-臨床表型之間的復雜關系仍然不清。本課題組作為中國CIP的主要研究團隊,2009年至今,僅收集到4例中國CIP患者,并于2011年發(fā)表了中國唯一一篇關于CIP患者的研究報告。基于此,本文重點研究中國僅有的3例未報道的CIP患者的基因型和表型關系。目的:篩查罕見病CIP中國患者的突變基因,研究基因型-表型之間的關系,探討其致病機制。方法:1.簽署患者、患者家屬的知情同意書;收集患者及其家系的疾病信息,并記錄患者、患者家屬的臨床表型(癥狀、影像學等);收集血樣,從全血中提取基因組DNA,通過基因芯片對患者進行基因突變檢測,檢測基因包括:SCN9A、SCN10A、SCN11A、NGF、NTRK1、PRDM12等60個與疼痛相關的基因。2.針對不同突變類型的基因,進行生物信息學分析:針對SCN9A基因的移碼突變和突變所在區(qū)域、讀碼框,分析移碼突變對Nav1.7蛋白結構的影響;針對SCN9A基因的內含子突變和所在部位,分析內含子突變對SCN9A基因剪接功能的影響;針對SCN9A基因的錯義突變,利用Clustal Omega軟件分析突變所在區(qū)域氨基酸殘基的保守性,利用Polyphen2軟件和SIFT軟件預測錯義突變對Nav1.7功能的影響。3.構建SCN9A野生型和突變型載體,用載體轉染HEK293細胞,獲得能夠表達野生型或突變型Nav1.7的HEK293細胞。針對內含子剪接區(qū)突變,進行體外剪接驗證,檢測內含子突變對Nav1.7 mRNA剪接的影響;針對錯義突變,通過全細胞膜片鉗實驗,確定錯義突變對Nav1.7電生理功能的影響;通過逆轉錄PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)、Western Blotting和免疫熒光檢測,確定錯義突變對Nav1.7表達水平和亞細胞定位的影響。結果:1.3例CIP患者的主要臨床表型為:1)先天性無痛:患者對傷害性刺激(如打針抽血、損傷、燙傷等)均無疼痛表現(xiàn)和不愉快表情,且常常發(fā)生自殘,如咬傷舌頭、手指等行為;2)嗅覺缺失,不能區(qū)分水、酒精和白醋的氣味。2.3例CIP患者均為復合雜合突變,共檢測出6個未報道的SCN9A基因突變,且未檢測到其他基因突變�；颊�1攜帶復合雜合移碼突變:c.850delG(p.Glu284Lysfs*3)和c.129_141delTGAAGAAGCCCCA(p.Asp43Glufs*43);患者2攜帶復合雜合內含子突變:c.4174-1GC(Intron 22)和c.4228-10AG(Intron23);患者3攜帶復合雜合錯義突變:c.296GA(p.Arg99His)和c.2749TG(p.Trp917Gly)。3.生物信息學分析發(fā)現(xiàn):患者1攜帶的SCN9A移碼突變c.850delG(p.Glu284Lysfs*3)和c.129_141delTGAAGAAGCCCCA(p.Asp43Glufs*43),分別位于Nav1.7蛋白domain I第一次跨膜區(qū)域和N端,導致Nav1.7蛋白在此處表達終止,產生截斷型Nav1.7通道蛋白,進而造成Nav1.7四個結構域幾乎全部缺失�；颊�2攜帶的SCN9A內含子突變c.4174-1GC和c.4228-10AG,分別位于Intron 22和Intron23剪接區(qū)域,會造成Nav1.7 mRNA的剪接異常。患者3攜帶SCN9A錯義突變c.296GA(p.Arg99His)和c.2749TG(p.Trp917Gly),這兩個突變所在部位氨基酸殘基Arg99和Trp917分別位于Nav1.7蛋白N端和domain II離子孔道區(qū)域,通過多序列比對發(fā)現(xiàn),這兩個氨基酸殘基在生物進化過程中、在人類鈉通道家族中高度保守;對Nav1.7錯義突變的致病性預測結果顯示,Nav1.7突變p.Arg99His和p.Trp917Gly具有很強的致病性,PolyPhen-2預測結果為:0.953和1.000(分值越高,越具有致病性)。4.對患者2的內含子突變進行體外功能驗證發(fā)現(xiàn):內含子突變c.4174-1GC和c.4228-10AG會導致Nav1.7 mRNA剪接異常,進而產生截斷型Nav1.7。5.對患者3的錯義突變進行全細胞膜片鉗檢測發(fā)現(xiàn):與野生型Nav1.7通道相比,p.Arg99His突變型Nav1.7通道電流明顯減少,約為野生型的一半;p.Trp917Gly突變型Nav1.7通道電流幾乎消失。Nav1.7表達水平檢測結果顯示,p.Arg99His突變和p.Trp917Gly突變均不影響Nav1.7 mRNA表達;p.Arg99His突變導致Nav1.7通道蛋白表達水平明顯下降,約為野生型的48%(P0.001),細胞膜Nav1.7表達水平也明顯下降,約為野生型的43%(P0.001),而p.Trp917Gly突變并沒有影響Nav1.7通道蛋白表達水平(P0.05)。結論:1.3例中國CIP患者的主要臨床表型是先天性無痛和嗅覺缺失,3例患者均攜帶復合雜合基因突變,共攜帶6個未報道的SCN9A基因突變,未發(fā)現(xiàn)其他基因突變。2.患者1的SCN9A基因移碼突變和患者2的SCN9A基因內含子突變,最終均產生截斷型Nav1.7。3.CIP患者3攜帶復合雜合SCN9A基因錯義突變,c.296GA,p.Arg99His和c.2749TG,p.Trp917Gly。對患者3攜帶的2個錯義突變進行全細胞膜片鉗實驗發(fā)現(xiàn),CIP患者3的突變Nav1.7仍然保留了部分通道功能,但患者表現(xiàn)為無痛,這與之前研究結論“Nav1.7功能完全缺失導致無痛”截然不同,患者3這種出人意料的基因型-表型關系非常值得關注。4.對患者3攜帶的錯義突變進行電生理和表達水平的檢測發(fā)現(xiàn),位于Nav1.7 N端的氨基酸殘基p.Arg99在維持Nav1.7表達和膜定位中發(fā)揮重要作用,位于Nav1.7離子孔道形成部位的氨基酸殘基p.Trp917在維持Nav1.7正常電生理功能中發(fā)揮重要作用,這將有助于Nav1.7靶向鎮(zhèn)痛藥物的開發(fā)。第二部分DRG內Nav1.7表達在術后疼痛中的作用研究背景:急性術后疼痛會嚴重影響患者術后恢復和生活質量,是目前臨床上亟待解決的一大難題,但其發(fā)病機制尚未完全清楚。目前認為,外周傷害性感受器興奮性增加是術后疼痛發(fā)生的重要機制,因此,從源頭上阻止疼痛信號向中樞的傳遞是預防和治療術后疼痛的關鍵。在疼痛信號的產生和傳導過程中,背根神經節(jié)(Dorsal Root Ganglion,DRG)是機體疼痛電信號向脊髓及以上中樞傳遞的紐帶,其中SCN9A基因編碼的鈉通道Nav1.7是介導DRG神經元動作電位的最主要通道。Nav1.7通過決定動作電位起始閾值調節(jié)神經元興奮性,進而在疼痛信號的產生和傳導中發(fā)揮重要作用。Nav1.7功能亢進會引起傷害性感受器過度興奮,進而導致紅斑肢痛癥、陣發(fā)性劇痛等疾病;Nav1.7功能缺失會引起傷害性感受器抑制,進而導致先天性無痛癥。動物實驗研究證實,Nav1.7敲除小鼠不再發(fā)生神經生長因子(Nerve Growth Factor,NGF)、弗氏完全佐劑(Complete Freund’s Adjuvant,CFA)等引發(fā)的急性炎性疼痛,Nav1.7抑制劑可抑制大鼠的急性炎性疼痛和急性刺激性疼痛。然而,目前關于Nav1.7在急性術后疼痛中的作用尚無研究。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),編碼Nav1.7的SCN9A基因多態(tài)性影響一般人群基礎疼痛敏感性和手術患者術后疼痛敏感性;CIP患者不僅對急性傷害性刺激(如打針、骨折等)表現(xiàn)為無痛,而且手術后也感覺不到疼痛。據(jù)此,我們推測DRG內Nav1.7增加可能在術后疼痛中發(fā)揮重要作用,有必要進一步對手術后DRG內Nav1.7的表達和作用進行深入研究。目的:檢測DRG內Nav1.7通道蛋白在足底切口大鼠術后疼痛過程中的動態(tài)表達,研究其表達在術后疼痛發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法:1.建立足底切口疼痛大鼠模型,分別在手術前和手術后2小時、24小時、48小時、72小時、120小時進行疼痛的行為學檢測:包括機械性疼痛縮爪閾值(Mechanical Withdrawal Threshold,MWT)、熱刺激縮爪潛伏期(Thermal Withdrawal Lantency,TWL)和累積疼痛評分,同時利用定量PCR(Quantitative Polymerase Chain Reaction,Q-PCR)和Western Blotting檢測大鼠DRG組織Nav1.7m RNA和蛋白的表達水平。2.將大鼠進行鞘內置管,根據(jù)利多卡因試驗鑒定置管是否成功,置管成功者用于后續(xù)實驗。大鼠隨機分為四組:空白對照(control)組、足底切口手術(incision)組、Nav1.7干擾慢病毒(SCN9A-RNAi-LV)+incision組、陰性對照慢病毒(NC-LV)+incision組。通過鞘內注射SCN9A-RNAi-LV或NC-LV,3天后建立足底切口疼痛大鼠模型,分別在手術前和手術后2小時、24小時、48小時進行疼痛的行為學測定,包括機械性疼痛敏感性、熱痛敏感性和累積疼痛評分。由于在前期實驗觀察到手術后2小時,大鼠疼痛閾值最低,Nav1.7表達最高,因此本研究選擇手術后2小時,通過Q-PCR檢測大鼠DRG內Nav1.7 m RNA的表達水平,同時通過Western Blotting和免疫組化檢測大鼠DRG組織內Nav1.7蛋白的表達水平。結果:1.足底切口大鼠手術后表現(xiàn)為MWT、TWL明顯下降,累積疼痛評分明顯增加(P0.05),同時大鼠DRG內Nav1.7 m RNA和Nav1.7通道蛋白表達明顯增加(P0.05)。手術后2小時,MWT和TWL下降最明顯,Nav1.7 m RNA和Nav1.7通道蛋白表達最高,隨后逐漸恢復。2.鞘內注射SCN9A-RNAi-LV后,大鼠DRG內Nav1.7 m RNA和蛋白表達明顯下降(P0.05),而不影響Nav1.8和Nav1.9表達(P0.05)。3.與incision組比較,SCN9A-RNAi-LV+incision組大鼠足底切口手術后DRG內Nav1.7增加明顯下降(P0.05),MWT、TWL明顯升高,累積疼痛評分明顯降低(P0.05)。結論:本研究發(fā)現(xiàn),大鼠足底切口手術后,其MWT、TWL明顯下降,累積疼痛評分明顯增加,同時大鼠DRG內Nav1.7 m RNA和Nav1.7通道蛋白表達明顯增加;而鞘內注射SCN9A-RNAi-LV特異性下調大鼠DRG內Nav1.7表達,大鼠手術后MWT、TWL明顯升高,累積疼痛評分明顯降低,這表明DRG內Nav1.7表達增加參與了術后疼痛的發(fā)生、發(fā)展。
【圖文】：

av1.7 通道蛋白 亞基二級結構和已報道的與 CIP 相關的 SCN9A 基因突變位點所色實心方框代表產生截斷型 Nav1.7 的 SCN9A 基因突變，紅色實心圓代表 SCN9。綠色實心方框代表本研究中，患者 1 攜帶的兩個 SCN9A 移碼突變，分別位于 N N-端和 domain I S5~S6 之間。綠色實心圓代表本研究中，患者 3 攜帶的兩個 SC分別位于 Nav1.7 通道蛋白 N 端和 Nav1.7 通道蛋白 domain II 選擇性過濾孔道部位 2011 年中國第一例 CIP 患者報道至今[31]，本課題組共收集到 4 例 CIP本研究總結了另外 3 例 CIP 患者的臨床表型，并且進行基因突變篩查，者 3 攜帶 SCN9A 錯義突變，并對此做重點研究。為了解患者臨床表型

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論10 HEPES，0.1 CdCl2，20 TEA-Cl，0.001 TTX，10-30 Glucose，NaOH 調節(jié) PH 至 7.410 HEPES，1 EGTA，5 TEA-Cl，，4 Mg-ATP，CsOH 調節(jié) PH 至 7.脂糖凝膠電泳緩沖液配置（50 ×TAE 緩沖液）：se 242g，Na2EDTA 2H2O 37.2g，醋酸 57.1 mL，加入適量去離至 1L，使用時稀釋 50 倍即可。設計設計如圖 2 所示：
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R614

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本文編號：2619685