【摘要】：骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是目前全球范圍中老年人最常見(jiàn)的骨關(guān)節(jié)退行性疾病,也是引發(fā)關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)功能喪失甚至導(dǎo)致殘疾的最常見(jiàn)骨關(guān)節(jié)疾病。流行病學(xué)調(diào)查表明,40歲以上人群原發(fā)性O(shè)A的總患病率為46.3%,且呈現(xiàn)隨年齡增長(zhǎng)而增高的趨勢(shì)。目前臨床上治療OA的保守方法和效果有限,最終還是需要進(jìn)行關(guān)節(jié)置換手術(shù)。然而手術(shù)帶來(lái)的并發(fā)癥對(duì)患者來(lái)說(shuō)都是災(zāi)難性的后果。OA的治療及疾病發(fā)展所致的殘疾都給家庭和社會(huì)帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此,探索關(guān)節(jié)軟骨退行性變的有效防治措施、阻斷OA發(fā)生進(jìn)程是臨床亟需解決的熱點(diǎn)問(wèn)題。在OA的進(jìn)展過(guò)程中,以軟骨下骨的病變最先開(kāi)始出現(xiàn),主要表現(xiàn)為骨質(zhì)重塑增加、軟骨下骨硬化、軟骨下骨板變厚、骨小梁微結(jié)構(gòu)破壞以及骨質(zhì)的流失。軟骨下骨的病變繼而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的一些變化,包括軟骨細(xì)胞增生、基質(zhì)降解蛋白酶的合成增多、軟骨細(xì)胞表型缺失、關(guān)節(jié)軟骨厚度變薄等等。作為力學(xué)支持結(jié)構(gòu),軟骨下骨的硬化也導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨就吸收更多的應(yīng)力,導(dǎo)致軟骨表型改變,基質(zhì)降解,軟骨退變的發(fā)生。也有研究認(rèn)為,OA的發(fā)展過(guò)程中盡管軟骨下骨的骨重建增強(qiáng),但因骨重建增加所致的局部礦化不足,引起軟骨下骨的彈性系數(shù)降低,導(dǎo)致其上方的關(guān)節(jié)軟骨在機(jī)械力或負(fù)荷作用下變形甚至開(kāi)裂。異常的力學(xué)作用如何導(dǎo)致軟骨下骨重塑的改變,以及如何進(jìn)一步導(dǎo)致軟骨退變,目前尚無(wú)定論。高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng),比如馬拉松、過(guò)度負(fù)重等競(jìng)技項(xiàng)目,是否會(huì)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生不可逆的破壞,至今尚無(wú)定論。雖然流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)調(diào)查發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)跑運(yùn)動(dòng)員中OA的患病率與正常人的群體并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別,但是,許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)跑運(yùn)動(dòng)員的膝關(guān)節(jié)會(huì)出現(xiàn)MRI(magnetic resonance imaging)可檢測(cè)的,且與持續(xù)性膝關(guān)節(jié)疼痛有關(guān)的病變。另外,大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明,不僅是高強(qiáng)度的跑步運(yùn)動(dòng),其他一些被動(dòng)的重復(fù)執(zhí)行的運(yùn)動(dòng),也可以導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨下骨骨質(zhì)代謝改變、關(guān)節(jié)軟骨的破壞,誘導(dǎo)OA的發(fā)生。因此,為了探討過(guò)度運(yùn)動(dòng)是否會(huì)對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生損傷,并深入研究其相關(guān)的軟骨下骨和關(guān)節(jié)軟骨的反應(yīng)機(jī)制,我們進(jìn)行了本次研究。我們將研究分成三部分,第一部分:明確高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)是否會(huì)導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨下骨重塑改變和軟骨退變;第二部分:探索在高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)的條件下,骨祖細(xì)胞定向募集異常導(dǎo)致軟骨下骨重塑增加的機(jī)制;第三部分:研究骨-軟骨復(fù)合體之間的物質(zhì)運(yùn)輸異常導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變的機(jī)制。第一部分高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨下骨重塑改變和軟骨退變[背景]在類(lèi)似于馬拉松的競(jìng)技運(yùn)動(dòng)中,長(zhǎng)期高強(qiáng)度跑步運(yùn)動(dòng)是否會(huì)導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)損傷目前仍存在有爭(zhēng)議。[目的]為了明確高強(qiáng)度跑步運(yùn)動(dòng)對(duì)于膝關(guān)節(jié)軟骨下骨和關(guān)節(jié)軟骨的影響。[方法和結(jié)果]將C57BL/6小鼠分成3個(gè)組,為對(duì)照組、中等強(qiáng)度組和高強(qiáng)度組,分別進(jìn)行不同強(qiáng)度的跑步運(yùn)動(dòng),4周后進(jìn)行膝關(guān)節(jié)MRI檢查,在T2加權(quán)脂肪抑制序列上觀察軟骨下骨內(nèi)信號(hào),結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的增加,脛骨和股骨髁髓腔內(nèi)的信號(hào)都逐漸上升,統(tǒng)計(jì)量化指標(biāo)顯示,高強(qiáng)度組的相對(duì)信號(hào)值明顯高于對(duì)照組(P=0.017和P=0.024)。在第5周處死小鼠,對(duì)小鼠的膝關(guān)節(jié)進(jìn)行Micro-CT掃描,分析計(jì)算軟骨下骨的形態(tài)學(xué)參數(shù),發(fā)現(xiàn)顯示小鼠脛骨軟骨下骨骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)(P=0.031 和P=0.0034)和骨小梁數(shù)量(trabecular number,Tb.N)明顯高于對(duì)照組和中等強(qiáng)度組(P值均0.001);骨小梁間隙(trabecular space,Tb.Sp)明顯低于對(duì)照組和中等強(qiáng)度組(P均0.001)。對(duì)小鼠膝關(guān)節(jié)標(biāo)本進(jìn)行番紅-固綠染色、HE染色,結(jié)果提示:高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組的膝關(guān)節(jié)軟骨面不平整,黏多糖染色出現(xiàn)局部丟失,高強(qiáng)度組鈣化軟骨層內(nèi)的肥大軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組(P=0.025),同時(shí)鈣化軟骨層體積(P0.001)和厚度(P=0.005)均高于對(duì)照組。不僅在鈣化軟骨層參數(shù)出現(xiàn)變化,高強(qiáng)度組的軟骨下骨板厚度較對(duì)照組(P0.001)和中等強(qiáng)度組(P=0.009)均明顯升高。[結(jié)論]高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨下骨內(nèi)骨髓損傷,并且軟骨下骨骨小梁出現(xiàn)重塑異常和軟骨表征的改變。需要進(jìn)一步研究高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致這些改變的具體機(jī)制。第二部分骨祖細(xì)胞募集異常導(dǎo)致軟骨下骨重塑失衡的機(jī)制研究[背景]我們?cè)诘谝徊糠值难芯恐邪l(fā)現(xiàn)了高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致軟骨下骨骨小梁骨重塑異常,而目前關(guān)于此現(xiàn)象的具體機(jī)制尚無(wú)定論;相關(guān)研究認(rèn)為骨祖細(xì)胞的募集對(duì)于骨形成具有重要作用,據(jù)此我們提出假說(shuō),高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)所致的骨重塑增加與骨髓腔內(nèi)骨祖細(xì)胞的異常募集有關(guān)。[目的]進(jìn)一步研究軟骨下骨髓腔內(nèi)骨祖細(xì)胞的異常募集在軟骨下骨骨質(zhì)重塑失衡的作用機(jī)制。[方法和結(jié)果]三維重建膝關(guān)節(jié)的CT數(shù)據(jù),高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組的骨體積/組織體積(BV/TV)較對(duì)照組(P=0.0048)和中等強(qiáng)度(P=0.015)組明顯增高(A,B)。用第一部分所獲得的標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)和Goldner三色染色,結(jié)果顯示強(qiáng)度組軟骨下骨內(nèi)膜表面的OCN表達(dá)明顯上升(P0.001),脛骨軟骨下骨成骨活性明顯高于其余兩組,但出現(xiàn)大片的類(lèi)骨質(zhì)和未礦化骨,同時(shí)破骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色結(jié)果提示軟骨下骨內(nèi)破骨細(xì)胞活性組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.21)。為了明確骨祖細(xì)胞在髓腔內(nèi)的分布,在跑步5周后對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨下骨髓腔內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè),發(fā)現(xiàn)過(guò)度運(yùn)動(dòng)后小鼠軟骨下骨表面的骨祖細(xì)胞(endosteal mesenchymal progenitor,EMP)占總細(xì)胞的百分比數(shù)較對(duì)照組明顯增加(P=0.034),細(xì)胞集落培養(yǎng)(CFU)的結(jié)果也表明高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組的骨祖細(xì)胞集落數(shù)相對(duì)值較對(duì)照組(P=0.028)和中等強(qiáng)度組(P=0.037)增多,但髓腔內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的集落數(shù)較中等強(qiáng)度組(P=0.0048)和對(duì)照組明顯減少(P=0.044)。為了體外模擬高強(qiáng)度應(yīng)力對(duì)細(xì)胞的作用,提取膝關(guān)節(jié)軟骨下骨髓腔內(nèi)的骨祖細(xì)胞培養(yǎng),用細(xì)胞牽拉器予貼壁細(xì)胞不同強(qiáng)度的應(yīng)力刺激,分別是0%應(yīng)變0 Hz頻率(對(duì)照)、5%應(yīng)變0.5 Hz頻率(5%,0.5 Hz),20%應(yīng)變1 Hz頻率(20%,1 Hz),通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)骨祖細(xì)胞的遷移能力隨應(yīng)力刺激強(qiáng)度的增加而下降。為了明確骨祖細(xì)胞的遷移和募集異常是否與初級(jí)纖毛的形成和功能障礙有關(guān),我們運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度應(yīng)力作用明顯抑制了組裝初級(jí)纖毛的重要成分——α-Tubulin在骨祖細(xì)胞中的表達(dá)。并且,α-Tubulin合成的驅(qū)動(dòng)因子KIF3A在軟骨下骨內(nèi)的基因表達(dá)也出現(xiàn)下調(diào)(P=0.0029)。進(jìn)一步利用免疫印跡(western blot)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與KIF3A合成相關(guān)的激動(dòng)因子PKA-C在高強(qiáng)度應(yīng)力刺激后表達(dá)下調(diào)。利用免疫定量檢測(cè)試劑盒和實(shí)時(shí)定量聚合連反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)明顯抑制軟骨下骨內(nèi)cAMP和AC6的表達(dá)(P均0.05)。[結(jié)論]高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)刺激軟骨下骨內(nèi)的AC6表達(dá)受抑制,從而抑制cAMP/PKA/KIF3A信號(hào)通路,導(dǎo)致α-Tubulin合成下降,骨祖細(xì)胞初級(jí)纖毛組裝和功能受損,出現(xiàn)過(guò)度募集于軟骨下骨,促使軟骨下骨質(zhì)重塑。第三部分 高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)通過(guò)抑制軟骨下骨PDGF-AA生成導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變機(jī)制研究[背景]在第一部分的研究中證實(shí)了高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變,同時(shí)很多研究認(rèn)為骨-軟骨復(fù)合體之間的物質(zhì)傳輸在關(guān)節(jié)軟骨退變中具有重要作用。血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor,PDGF)-AA是促進(jìn)細(xì)胞存活,調(diào)控細(xì)胞分化的重要因子,而PDGF/Akt在骨-軟骨復(fù)合體中的作用目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。[目的]明確在高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)作用下軟骨下骨代謝變化如何導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨終末分化以及軟骨退變。[方法和結(jié)果]為了明確高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后關(guān)節(jié)軟骨的表型特征,利用免疫組化檢測(cè)COL10和MMP13在關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)的表達(dá)水平,結(jié)果顯示高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組的鈣化軟骨層內(nèi)COL10和MMP13陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均高于對(duì)照組(P均0.001)和中等強(qiáng)度組(P=0.0052和0.001),同時(shí)TUNEL試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度組的凋亡細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組(P=0.002)和中等強(qiáng)度組(P=0.007)明顯增多。提取小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨下骨的mRNA進(jìn)行RT-PCR,發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可明顯抑制軟骨下骨內(nèi)Pdgfa的表達(dá)(P均0.01),該結(jié)果在免疫組化實(shí)驗(yàn)中也得到驗(yàn)證。為了進(jìn)一步明確是否高強(qiáng)度應(yīng)力刺激抑制了軟骨下骨內(nèi)的成骨細(xì)胞合成PDGF-AA,從而導(dǎo)致了上層軟骨的病變,體外培養(yǎng)MC3T3前成骨細(xì)胞并進(jìn)行不同強(qiáng)度的應(yīng)力刺激,以模擬軟骨下骨的應(yīng)力環(huán)境。隨著應(yīng)力刺激強(qiáng)度的增加,PDGF-AA的基因和蛋白表達(dá)水平下降(P均0.05);同時(shí)收集刺激后的條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)軟骨細(xì)胞(mechanical treatment,MT),培養(yǎng) 3 天后細(xì)胞 Mmp13、Col10a1 的表達(dá)上調(diào)(P均0.05),而條件培養(yǎng)基中加入10ng/mL PDGF-AA(MT+PDGF)后共培養(yǎng)可逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象(P均0.05)。共培養(yǎng)后細(xì)胞凋亡染色顯示類(lèi)似結(jié)果:MT+PDGF可明顯抑制MT共培養(yǎng)導(dǎo)致的軟骨細(xì)胞死亡(P均0.05),說(shuō)明PDGF-AA合成減少導(dǎo)致了軟骨細(xì)胞的終末分化和凋亡。繼續(xù)深入研究發(fā)現(xiàn),高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)不僅抑制軟骨下骨PDGF-AA的表達(dá),關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)p-Akt的活性也受到抑制(P=0.018),體外實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí),軟骨細(xì)胞經(jīng)MT條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)后,Akt的磷酸化水平下降,而加入PDGF-AA后得到磷酸化水平恢復(fù)。[結(jié)論]在高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下,從軟骨下骨內(nèi)向關(guān)節(jié)軟骨定向運(yùn)輸?shù)腜DGF-AA和關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)PDGF/Akt信號(hào)通路的活性受到抑制,而這些對(duì)于關(guān)節(jié)軟骨表型的保持,延緩軟骨細(xì)胞終末分化和凋亡具有重要的作用。
【圖文】：

包括軟骨細(xì)胞增生、軟骨基質(zhì)合成、軟骨細(xì)胞中促炎因子（包括白細(xì)胞介素－１，逡逑ＩＬ－１）的產(chǎn)生增多、一些酶類(lèi)，如基質(zhì)降解蛋白酶的合成增多、軟骨細(xì)胞表型缺逡逑失、關(guān)節(jié)軟骨厚度變薄等等（圖１）邋［１２］。軟骨下骨的硬化也導(dǎo)致了其作為支持結(jié)逡逑構(gòu)來(lái)吸收力學(xué)作用的能力下降，因此關(guān)節(jié)軟骨就吸收了更多的應(yīng)力和應(yīng)變，導(dǎo)逡逑致軟骨表型改變，基質(zhì)降解，軟骨退變的發(fā)生［１４］。也有研宄認(rèn)為，０Ａ的發(fā)展過(guò)逡逑程中膝關(guān)節(jié)髁內(nèi)的骨小梁厚度增加、骨小梁間隙變窄并出現(xiàn)骨基質(zhì)礦化減少，逡逑導(dǎo)致骨硬度降低，，且以退化的關(guān)節(jié)軟骨下方的軟骨下骨病變最顯著［１５］。盡管軟逡逑骨下骨的骨重建增強(qiáng)，但因骨重建增加所致的局部礦化不足，引起軟骨下骨的逡逑彈性系數(shù)降低，導(dǎo)致其上方的關(guān)節(jié)軟骨在機(jī)械力或負(fù)荷作用下變形甚至開(kāi)裂［１６］。逡逑因此，０Ａ發(fā)生中軟骨的退行性改變主要繼發(fā)于軟骨下骨的病變［１７］。逡逑軟骨下骨骨質(zhì)合成代謝由成骨細(xì)胞的成骨作用與破骨細(xì)胞的骨吸收作用共逡逑同協(xié)調(diào)作用下完成的

為了進(jìn)一步觀察高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨表型的影響，我們進(jìn)行ＨＥ染色和番逡逑紅－固綠染色。番紅－固綠染色結(jié)果提示：高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組的膝關(guān)節(jié)軟骨面不平整，逡逑黏多糖染色出現(xiàn)局部丟失，并且表層軟骨出現(xiàn)部分裂隙（圖１－２邋Ａ）。計(jì)算鈣化逡逑軟骨層內(nèi)的肥大軟骨細(xì)胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度組的肥大軟骨細(xì)胞數(shù)量高于對(duì)照組逡逑（２２４．１０±９０．０８邋個(gè)／ｍｍ２ｖｓ７９．２６土３６．４１邋個(gè)／ｍｍ２，邋Ｎ＝６／組，Ｐ＝０．０２５）（圖邋１－２邋Ａ，逡逑Ｃ）。番紅－固綠染色和ＨＥ結(jié)果均提示，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后，小鼠膝關(guān)節(jié)的鈣化軟骨逡逑層厚度較對(duì)照組明顯升高（４２．６８±４．８６ｎｍｖｓ３５．８４±４．６３｜ｉｍ，邋Ｎ＝１０，邋／ＭＸＯＯＳ）逡逑（圖１－２邋Ｂ，邋Ｃ）；同時(shí)，高強(qiáng)度組的鈣化軟骨層體積也明顯高于對(duì)照組（６００７７．６２逡逑±６１９６．３３邋ｐｍ２ｖｓ邋４８３５２．１８±２８９７．４８邋ｐｍ２，邋Ｎ＝１０８／組，ＰＯ．ＯＯｌ）和中等強(qiáng)度組逡逑（６００７７＿６２±６１９６．３３邋（ａｍ邋ｖｓ邋５２４６６．４１邋±５４５３．１５邋｜ｉｍ２，邋Ｎ＝１０，邋Ｐ＝０．００２）（圖邋１－２邋Ｂ，逡逑Ｃ）。不僅是鈣化軟骨層參數(shù)出現(xiàn)變化
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R687.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 薛慶云;王坤正;裴福興;朱漢民;金大地;陶天遵;李恩;李寧華;張耀南;王曉濱;紀(jì)泉;;中國(guó)40歲以上人群原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎患病狀況調(diào)查[J];中華骨科雜志;2015年12期

本文編號(hào)：2618899