【摘要】：創(chuàng)傷性顱腦損傷(Traumatic Brain Injury,TBI)是臨床常見的危重急癥,具有較高的致死和致殘率。而繼發(fā)性腦損傷屬于可逆性病理過程,是臨床救治的主要方面,其中過度的神經(jīng)炎癥反應(yīng)一直認(rèn)為是繼發(fā)性腦損害的重要病理機(jī)制。MANF(Mesencephalic Astrocyte-derived Neurotrophic Factor)作為一種新型神經(jīng)營養(yǎng)因子,對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激敏感。已有的研究表明,其在腦缺血模型中具有明顯的腦保護(hù)作用,并且可在小膠質(zhì)細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá),可能參與了腦缺血后神經(jīng)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。但目前為止,仍未見MANF在TBI后繼發(fā)性顱腦損傷中的作用及機(jī)制報道。我們希望據(jù)此課題研究,不僅為TBI后繼發(fā)性腦損傷的病理學(xué)新機(jī)制提供理論依據(jù),同時也對臨床以此為靶點(diǎn)治療重型TBI的新技術(shù)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),從而顯著降低該病的致殘率及死亡率,具有極大的經(jīng)濟(jì)與社會價值。第一部分TBI誘導(dǎo)大鼠腦組織內(nèi)源性MANF的表達(dá)目的創(chuàng)建大鼠重型TBI模型并評估其特點(diǎn)和重復(fù)性;觀察TBI后腦組織中內(nèi)源性MANF蛋白的表達(dá),并進(jìn)一步確定表達(dá)MANF的細(xì)胞類型及和分布特征。方法將48只SD雄性成年大鼠隨機(jī)分為對照組(Sham組,n=24)、顱腦創(chuàng)傷組(TBI組,n=24)。TBI組采用改良的Feeney′s自由落體撞擊法(50g×20cm)構(gòu)建創(chuàng)傷模型。Sham組僅磨除顱骨、不予撞擊操作。造模后24小時,兩組均給予行為學(xué)、頭顱MRI、HE染色及免疫熒光等檢測方法予以評估。在證實(shí)模型組病理損傷有效且穩(wěn)定后,選取挫傷灶周圍腦組織行免疫組化、逆轉(zhuǎn)錄PCR及免疫印跡法明確創(chuàng)傷后MANF的表達(dá)改變;同時應(yīng)用免疫熒光及雙標(biāo)的方法了解腦組織中MANF蛋白表達(dá)的空間和細(xì)胞差異。結(jié)果創(chuàng)傷后24小時,TBI組大鼠的Garcia評分明顯下降、頭顱MRI之T2 WI圖像可見彌漫高信號腦水腫改變、HE切片可見明顯神經(jīng)細(xì)胞及纖維的損傷、免疫熒光染色提示創(chuàng)傷后小膠質(zhì)細(xì)胞的明顯激活,且每個動物模型間的病理損傷程度均相似。逆轉(zhuǎn)錄PCR、免疫印跡及免疫組化均證實(shí)TBI后挫傷灶周圍MANF的表達(dá)水平顯著增加(P0.01)。免疫熒光檢測提示其分布較為廣泛,在同側(cè)大腦皮層及海馬組織中均較明顯;另外MANF蛋白的表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞中均有體現(xiàn),且主要定位于細(xì)胞質(zhì)。結(jié)論該TBI大鼠模型所致的病理改變成功模擬出臨床顱腦創(chuàng)傷的多個重要特征,且重復(fù)性好,為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。TBI可誘導(dǎo)腦組織中內(nèi)源性MANF蛋白的表達(dá)上調(diào),并廣泛體現(xiàn)在不同的部位和細(xì)胞中,可能是急性期腦組織自身的保護(hù)性調(diào)節(jié)機(jī)制。第二部分MANF對TBI大鼠的腦保護(hù)作用及其初步機(jī)制研究第一節(jié)重組人MANF對TBI大鼠腦保護(hù)作用及其劑量依賴性目的明確MANF蛋白能否在TBI急性期發(fā)揮腦保護(hù)作用,并初步探討其劑量相關(guān)性。方法96只SD雄性成年大鼠,隨機(jī)分為對照組(Sham組,n=24)、顱腦創(chuàng)傷組(PBS組,n=24)、小劑量MANF治療組(MANF 5μg組,n=24)和大劑量MANF治療組(MANF 20μg組,n=24)。MANF治療組給予TBI造模大鼠側(cè)腦室注射不同劑量的人重組MANF蛋白(5μg/20μL或20μg/20μL),PBS組給予TBI造模大鼠側(cè)腦室注射相同體積的PBS溶液(20μL),Sham組僅磨除顱骨、不予撞擊操作。造模并給藥后24小時,各組動物均予以行為學(xué)及頭顱MRI檢查,并選取挫傷灶周圍腦組織行免疫熒光(Neu N染色)及腦組織含水量等檢測,同時統(tǒng)計每組動物的死亡率。結(jié)果創(chuàng)傷后24小時,PBS組大鼠的Garcia評分顯著下降、T2 WI圖像及腦組織含水量提示腦水腫明顯、免疫熒光提示挫傷灶周圍存活神經(jīng)元(Neu N陽性)數(shù)量較少,且該組動物死亡率較高。應(yīng)用小劑量MANF進(jìn)行治療后,上述指標(biāo)均較PBS組有所好轉(zhuǎn),但差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。而應(yīng)用大劑量MANF進(jìn)行干預(yù)后,上述指標(biāo)均較PBS組明顯好轉(zhuǎn),除死亡率外,均具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論TBI早期應(yīng)用MANF蛋白進(jìn)行干預(yù)治療,可減輕大鼠腦組織的急性期病理損害、降低其致殘率和死亡率,具有腦保護(hù)作用,且在一定范圍內(nèi)大劑量效果更明顯。第二節(jié)重組人MANF抑制TBI大鼠繼發(fā)性神經(jīng)炎癥反應(yīng)及降低血腦屏障通透性目的通過觀察MANF蛋白治療后大鼠腦組織中的炎癥指標(biāo)、p65表達(dá)及血腦屏障改變,初步探討MANF在TBI急性期腦保護(hù)作用的部分機(jī)制。方法將54只SD雄性成年大鼠,隨機(jī)分為對照組(Sham組,n=18)、顱腦創(chuàng)傷組(PBS組,n=18)和MANF治療組(n=18)。在MANF治療組中,將20μg/20μL人重組MANF蛋白注射到TBI模型大鼠的側(cè)腦室中。在PBS組中,將相同體積的PBS溶液注射到TBI模型大鼠的側(cè)腦室中。Sham組僅磨除顱骨、不予撞擊操作。造模后24小時,選取挫傷灶周圍腦組織行免疫熒光(CD68染色)、逆轉(zhuǎn)錄PCR及免疫印跡檢測,闡明MANF對小膠質(zhì)細(xì)胞和促炎因子(如IL-1β、TNF-α等)活化和NF-κB通路蛋白(p65)表達(dá)的影響;此外,活體靜脈注射EB染液以確定MANF蛋白對血腦屏障通透性的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果創(chuàng)傷后24小時,PBS組大鼠挫傷灶周圍小膠質(zhì)細(xì)胞被激活,胞體變大,且數(shù)目明顯增加,與Sham組相比具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01);而應(yīng)用大劑量MANF干預(yù)后,活化小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少(P0.05)。同時PBS組挫傷灶周圍IL-1β、TNF-α及p65表達(dá)水平明顯升高;應(yīng)用大劑量MANF干預(yù)可顯著降低其表達(dá)程度(P0.05)。此外,在PBS組的挫傷灶周圍觀察到明顯EB染料滲出,與Sham組相比具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);而在大劑量MANF的干預(yù)下,EB染料滲出明顯減少(P0.05),急性期血腦屏障的通透性顯著降低。結(jié)論MANF可通過抑制TBI急性期的細(xì)胞和遞質(zhì)炎癥反應(yīng)發(fā)揮腦保護(hù)作用,此機(jī)制可能與NF-κB通路活性的抑制密切相關(guān)。而MANF維持急性期血腦屏障的穩(wěn)定性,可能是其腦保護(hù)作用的另外一種途徑。
【圖文】：

圖 1 大鼠 TBI 模型制作裝置（改良 Feeney′s 方法）Fig.1 The apparatuses setting up the TBI model of rats (improved Fmethod)神經(jīng)行為功能評分究采用改良的 Garcia 評分來反映顱腦創(chuàng)傷后大鼠的行為變化，并損傷程度。實(shí)驗(yàn)采用雙盲法，，評分列表中包括 6 項(xiàng)檢測內(nèi)容，包體感覺、運(yùn)動、反射和協(xié)調(diào)性等方面。前 3 項(xiàng)評分為 0-3 分，后3 分，總分最低分為 3 分、最高分為 18 分。檢測得分愈低則表示神重，以 3 次重復(fù)檢測結(jié)果的平均分為最終得分，每次檢測過程間檢查內(nèi)容與評分如下：運(yùn)動（將大鼠放入籠中 5 分鐘）：0. 無自主運(yùn)動；1. 很少運(yùn)動；

圖 2 大鼠 TBI 后 24 小時神經(jīng)行為學(xué)評分的改變Fig.2 The modified Garcia score of rats in different groups at 24 hours after traumaData are expressed as mean ± SD. n=6. **P<0.01, compared with the Sham group. TBI 后頭顱 MRI 的表現(xiàn)在活體大鼠上直觀的了解 TBI 后腦組織的損傷程度和范圍，于創(chuàng)傷后 24頭顱 MRI 檢查，通過 T2 WI 圖像予以反映。我們發(fā)現(xiàn)與對照（Sham）組I 組在右側(cè)額頂葉可見明顯的皮層連續(xù)性中斷，其周邊存在彌漫性高信號變、局部腦腫脹明顯，伴有同側(cè)腦室的受壓和閉塞，但對側(cè)大腦半球卻信號及形態(tài)的異常表現(xiàn)。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R651.15

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2618666