【摘要】：孕期及出生后早期動(dòng)物暴露于全身麻醉藥(GA)導(dǎo)致發(fā)育期腦神經(jīng)毒性。迄今,臨床上未出現(xiàn)比GA更安全有效的替代藥物。因此,如何修復(fù)GA介導(dǎo)發(fā)育期腦神經(jīng)毒性是一個(gè)迫在眉睫的問(wèn)題。在腦損傷時(shí),靜止期腦神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)重新被激活,增殖、分化產(chǎn)生新生神經(jīng)元修復(fù)受損腦區(qū)。NSC增殖是內(nèi)源性修復(fù)的關(guān)鍵始動(dòng)環(huán)節(jié)。研究GA調(diào)節(jié)NSC增殖作用對(duì)修復(fù)GA介導(dǎo)的腦神經(jīng)毒性具有重要的臨床意義。在小鼠大腦室管膜下區(qū)、嗅球及齒狀回發(fā)現(xiàn)大量與神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型、發(fā)育進(jìn)程、人類(lèi)疾病相關(guān)的特異性長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)。研究表明lncRNA作為競(jìng)爭(zhēng)性RNA調(diào)節(jié)靈長(zhǎng)類(lèi)NSC增殖。究竟哪些lncRNA參與調(diào)控GA對(duì)NSC增殖作用及如何調(diào)控?仍一無(wú)所知。第一章適宜基因芯片檢測(cè)的七氟醚暴露NSC模型構(gòu)建目的:構(gòu)建適宜基因芯片檢測(cè)lncRNA表達(dá)譜的七氟醚暴露NSC模型。方法:新生大鼠海馬來(lái)源的NSC原代培養(yǎng)后暴露于七氟醚和對(duì)照氣體0、3、6、12h,CCK-8檢測(cè)NSC增殖能力,流式細(xì)胞儀檢測(cè)NSC存活率,瓊脂糖電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞樣品質(zhì)量。結(jié)果:與對(duì)照組比較,七氟醚呈暴露濃度和時(shí)間依賴(lài)性抑制離體培養(yǎng)NSC增殖和存活,2.4%七氟醚暴露6 hNSC細(xì)胞樣品質(zhì)量符合基因芯片檢測(cè)質(zhì)控要求。結(jié)論:暴露于2.4%七氟醚6 h離體培養(yǎng)NSC適宜于基因芯片檢測(cè)。第二章七氟醚暴露NSC中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜研究目的:研究七氟醚暴露后NSC中l(wèi)ncRNA差異性表達(dá)譜,篩選與NSC增殖相關(guān)的目標(biāo)lncRNA。方法:采用lncRNA基因芯片檢測(cè)七氟醚暴露NSC中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜,qPCR驗(yàn)證隨機(jī)挑選的10個(gè)lncRNA和10個(gè)mRNA表達(dá)水平,經(jīng)生物信息學(xué)分析,篩選并驗(yàn)證MRAK080926和MRAK157758及其鄰近基因。結(jié)果:qPCR結(jié)果與基因芯片表達(dá)譜一致,Wnt5a和Gadd45a與NSC增殖相關(guān),上調(diào)表達(dá)的MRAK080926和MRAK157758分別與鄰近基因Wnt5a和Gadd45a呈正相關(guān)。結(jié)論:MRAK080926和MRAK157758與七氟醚對(duì)NSC增殖作用相關(guān)。第三章MRAK080926調(diào)控七氟醚對(duì)NSC增殖作用目的:探討MRAK080926調(diào)控七氟醚對(duì)NSC增殖影響,初步研究其調(diào)控途徑。方法:沉默MRAK080926后采用細(xì)胞克隆平板實(shí)驗(yàn)、CCK-8及EDU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)七氟醚暴露的NSC增殖能力,流式細(xì)胞儀和Tunel實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NSC存活率,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和ROS水平,qPCR檢測(cè)MRAK080926和Wnt5a mRNA表達(dá),Western blot檢測(cè)Wnt5a、RYK及BAX蛋白表達(dá)。結(jié)果:沉默MRAK080926后促進(jìn)七氟醚暴露的NSC增殖,MRAK080926表達(dá)和Wnt5a/RYK-ROS信號(hào)軸活性也隨之下調(diào),促進(jìn)G0期NSC進(jìn)入細(xì)胞周期,S期延長(zhǎng)。結(jié)論:沉默MRAK080926挽救七氟醚暴露NSC增殖作用,與抑制Wnt5a/RYK-ROS信號(hào)軸和促進(jìn)NSC再次進(jìn)入細(xì)胞周期相關(guān)�？偨Y(jié):七氟醚抑制NSC增殖,lncRNA表達(dá)譜存在明顯差異,MRAK080926表達(dá)明顯上調(diào),沉默MRAK080926后抑制Wnt5a/RYK-ROS信號(hào)軸,促進(jìn)NSC增殖。
【圖文】：

圖１－１原代ＮＳＣ免疫熒光圖像逡逑采用巢蛋白（Ｎｅｓｔｉｎ）作為ＮＳＣ標(biāo)記（紅色），ＧＦＡＰ邋（紅色）作為星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)、Ｎ（紅色）作為神經(jīng)元標(biāo)記物染色的ＮＳＣｓ的免疫熒光圖像，使用４’６－二脒基－２－苯基吲（ＤＡＰＩ）（藍(lán)色）對(duì)核進(jìn)行復(fù)染色。標(biāo)尺：ｌＯＯｐｍ逡逑Ｆｉｇ．邋１－１．邋Ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ邋ｏｆ邋ＮＳＣ邋ｉｎ邋ｃｕｌｔｕｒｅ．逡逑Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｉｍａｇｅ邋ｏｆ邋ＮＳＣ邋ａｔ邋ｐａｓｓａｇｅ邋３邋ｓｔａｉｎｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ａｎｔｉ－ｎｅｓｔｉｎ邋ａｎｔｉｂｏｄｙ邋（ｒｅｄ）邋ａｓ邋ａＮＳＣ邋ｍａｒｋｅｒ，邋ＧＦＡＰ邋（ｒｅｄ），邋ａｓ邋ａｎ邋ａｓｔｒｏｃｙｔｅ邋ｍａｒｋｅｒ，邋ｏｒ邋ＮＳＥ邋（ｒｅｄ），邋ａｓ邋ａ邋ｎｅｕｒｏｎａｌ邋ｍａｒｋｅｒ，邋ｗｉｔｈ逡逑ｎｕｃｌｅｉ邋ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎｅｄ邋ｕｓｉｎｇ邋４，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ邋（ＤＡＰ１）邋（ｂｌｕｅ）．邋Ｂａｒ：邋１００邋ｊａｍ．逡逑２七氟醚抑制ＮＳＣ增殖逡逑為了探討七氟醚暴露濃度和時(shí)間誘導(dǎo)ＮＳＣ增殖變化的趨勢(shì)，我們采用胞毒性較低的ＣＣＫ－８實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞ＯＤ４５0ｎｍ，通過(guò)細(xì)胞活性間接反映Ｎ殖情況。不同濃度的七氟醚或不同暴露時(shí)間對(duì)細(xì)胞增殖影響不同，差異具

逑無(wú)此效應(yīng)。由此可見(jiàn)，七氟醚呈暴露濃度和暴露時(shí)間依賴(lài)性介導(dǎo)ＮＳＣ增殖受逡逑抑制（圖１－２）。逡逑＾邐－ａ－邋ＮＳＣｓ＋１，２％ｓｅｖｏｆｌｕｒａｎｅ逡逑Ｉ１１０］邐ＮＳＣｓ＋２．４％ｓｅｖｏｆｌｕｒａｎｅ逡逑！邋１００－邐．邐ＮＳＣｓ＋３．６％ｓｅｖｏｆｌｕｒａｎｅ逡逑ｉ邋８。逡逑Ｉ７０－逡逑＝ｓ邋６０－Ｉ邐．邐．邐．逡逑ｕ邋０邐５邐１０邐１５逡逑ｄｕｒａｔｉｏｎ逡逑圖１－２邋ＣＣＫ８檢測(cè)不同濃度七氟醚暴露不同時(shí)間對(duì)ＮＳＣ增殖的影響逡逑＊表示與對(duì)照組相比：戶(hù)＜0．0５；邐＃表示與暴露６ｈ相比：尸＜０．０５逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ｓｅｖｏｆｌｕｒａｎｅ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｔｉｍｅ－ｍａｎｎｅｒ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ逡逑ａｎｄ邋ａｐｏｐｔｏｓｉｓ邋ｏｆ邋ＮＳＣ．逡逑＊：ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ，尸＜０．０５．邋＃：邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｓｅｖｏｆｌｕｒａｎｅ邋ｅｘｐｏｓｕｒｅ邋ｆｏｒ邋６邋ｈ逡逑２．３七氟醚暴露后ＮＳＣ存活逡逑為建立適宜基因芯片檢測(cè)的ＮＳＣ模型，篩選七氟醚暴露濃度和時(shí)間。結(jié)合逡逑ＣＣＫ－８實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道［５］，選擇１邋ＭＡＣ邋（２．４％）七氟醚探討不同暴露時(shí)間逡逑對(duì)ＮＳＣ存活的影響。２．４％七氟醚抑制ＮＳＣ存活，不同暴露時(shí)間抑制ＮＳＣ存活逡逑率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義0Ｐ＝0．000），隨著七氟醚暴露時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡和壞死逡逑逐漸增多
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R614

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本文編號(hào)：2618522