【摘要】：背景與目的:心力衰竭晚期,通常會選擇心臟移植手術來進行治療,可有效緩解病情,但是在心臟移植手術以后,會產生免疫排斥反應,嚴重影響到移植手術的效果。尋找新的抑制移植排斥反應的方法是當今醫(yī)學面臨的重要問題之一,本課題利用異基因大鼠異位心臟移植模型,研究骨髓間充質干細胞對移植心臟存活的影響及其對心臟移植大鼠免疫功能的調節(jié)作用。方法:1.大鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)的分離、培養(yǎng):取10只Wistar大鼠在無菌條件下取其股骨、下肢脛骨骨髓,用含體積分數(shù)為15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液對骨髓腔進行反復沖洗,收集骨髓沖洗液并反復抽吸吹打獲得單細胞懸液,用注射器回收細胞懸液于10ml離心管中,離心后去上清,將沉淀通過含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重新懸浮,然后添加密度為1.085g/ml的Ficoll淋巴細胞分離液,離心分層,取出乳白色單個核細胞層,由包含15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液進行重新懸浮,在25cm~2塑料培養(yǎng)瓶容器內進行接種,放置在37℃環(huán)境內,含量為5%CO_2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),約2天后更換培養(yǎng)液,以后每周換液2次,借助倒置顯微鏡設備進行觀察,當細胞出現(xiàn)80%融合,此時開始傳代培養(yǎng),獲得第4-6代細胞備用。2.MSCs的鑒定:根據(jù)細胞自我更新增殖能力、形態(tài)特征及細胞表面標志對MSCs進行鑒定。倒置顯微鏡下觀察細胞增殖和形態(tài);細胞免疫化學染色及流式細胞儀檢測MSCs表面CD29、CD90、CD34和CD45表達。3.MSCs移植:在心臟移植術前一周對實驗組受者Wistar大鼠通過尾靜脈注射MSCs,每只大鼠注射2×10~5個MSCs(0.5m L),隔天注射一次,心臟移植當天和移植后3天繼續(xù)注射MSCs。對照組注射等劑量氯化鈉注射液。4.制備心臟異位移植大鼠模型:Lewis大鼠20只作為供體,Wistar大鼠和20只作為受體,采用套管法建立大鼠頸部心臟移植模型。手術分離取出Lewis大鼠的心臟,將其升主動脈和肺動脈根部分離,用50U/ml的O-4℃肝素生理鹽水對管腔沖洗,通過腦棉包裹心臟備用。分離Wistar大鼠頸外靜脈和頸總動脈并于遠端切斷、結扎并用血管穿刺管外鞘管進行固定。將供心主動脈與受體右頸總動脈吻合固定,將供心肺動脈與受體右頸外靜脈吻合固定,移植心臟位于右側頸部皮下,每日觀察大鼠心跳、精神狀態(tài)。手術48小時之后,如果移植心臟停跳,手術不成功。如果移植心臟跳動48h以上,即可視為模型建立成功。5.細胞因子IL-2、IL-10和T細胞亞群檢測:心臟移植術后7d,采用ELISA法檢測MSCs注射組和對照組大鼠血清白細胞介素2、白細胞介素10表達水平,流式細胞術檢測大鼠血液中T細胞亞群在淋巴細胞中所占比例。6.移植心臟存活時間及病理組織學觀察:術后7d實驗組和對照組各取一半大鼠,處死后對移植心臟進行病理學觀察;另一半大鼠繼續(xù)觀察移植心臟存活天數(shù),每日觀察大鼠精神狀態(tài),按時觸診移植心臟,觀察移植心臟搏動幅度、節(jié)律及速度。結果:1.MSCs形態(tài)、增殖和細胞表面標志檢測:骨髓單個核細胞培養(yǎng)1-3d細胞逐漸貼壁、由圓形向多角形過渡,傳2-3代后細胞形態(tài)呈現(xiàn)典型的扁平、貼壁、長索狀或多角形;細胞增殖明顯,每3天傳代一次,隨傳代次數(shù)增加,細胞形態(tài)均一度增強;收集傳4-6代細胞,進行細胞表面標志檢測。結果顯示:MSCs CD29、CD90表達陽性率分別為98.42%、97.73%,而CD34和CD45表達陽性率分別為1.35%、2.52%,符合骨髓MSCs的特征。2.MSCs對移植心臟存活時間的影響:對兩組的術后移植心臟存活時間進行統(tǒng)計和比較,結果顯示:MSCs注射組心臟存活時間為(14.25±2.15)d,顯著長于對照組(7.15±1.35)d,P0.05。3.MSCs對心臟移植大鼠IL-2、IL-10和T細胞亞群的影響:術后7d,ELISA法檢測分別心臟+MSC移植組和心臟移植組大鼠的血清白介素2、白介素10表達水平,兩組白介素2水平分別是248.15±25.23 pg/ml、230.25±20.35 pg/ml,二者差異無統(tǒng)計學意義,P0.05。但心臟+MSC移植組的血清白介素10為160.23±18.75 pg/ml,顯著高于心臟移植組(80.25±12.26 pg/ml),P0.05。術后7d,對兩組大鼠血中T細胞亞群在淋巴細胞中所占比例進行檢測和比較,發(fā)現(xiàn)心臟+MSC移植組的CD4~+、CD4~+/CD8~+、CD4~+CD25~(high)、CD4~+CD25~(high)Foxp3~+所占比例均顯著高于心臟移植組,P0.05。4.移植心臟的組織病理學觀察:術后7d獲得移植心臟組織標本進行病理學觀察發(fā)現(xiàn),未注射MSC的心臟移植組的心肌組織有淋巴細胞及單核細胞大量浸潤現(xiàn)象,末梢小血管內血栓形成等超急性排斥反應的特征病變,存在明顯的心肌間質水腫、出血,存在不同程度的心肌黏液性壞死和心肌細胞變性壞死。而心臟+MSC移植組的心肌組織中存在少量的淋巴細胞浸潤,出現(xiàn)灶性心肌細胞損害,心肌間質可觀察到輕微出血和水腫,較之心臟移植組炎性反應程度較輕。結論:對接受心臟移植的大鼠實施骨髓間充質干細胞治療可延長術后心臟移植物的存活時間。MSCs有可能通過調節(jié)大鼠的免疫功能,對器官移植排斥反應發(fā)揮一定抑制作用。
【圖文】：

材料與方法后在分支處切斷、結扎。然后在其頸外靜脈近心端于遠端切斷、結扎，在其末尾處利用牽引線在 16G脈，再通過顯微鑷夾翻轉血管，使其位于 16G 血管進行固定，可通過 6-0 絲線環(huán)進行。其次再進行頸總右邊胸鎖乳突肌進行切斷，并結扎，再根據(jù)以上方刺管外鞘管。

圖 2.2 供體大鼠心臟離體后修理鼠右邊頸部位置放置通過包裹在腦棉里的，確保供心放置位置與切口相符，然后通過鼠 2 根血管進行觀察，，確保其通暢。然后再在其中插進受體大鼠的頸總動脈套管，結扎。并采用相同方法，讓供體肺動脈相連于首先放開靜脈，之后再放開動脈，然后在漸轉換成復跳，再經過 5-10min 之后，即可進行相應調整，避免其血管彎曲受到壓迫合。大鼠在 15-30min 后就能行動，手術后不(70±15)min，而在手術過程中，冷缺血時
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R654.2

【參考文獻】

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本文編號：2610175