【摘要】：背景與目的:心力衰竭晚期,通常會選擇心臟移植手術(shù)來進(jìn)行治療,可有效緩解病情,但是在心臟移植手術(shù)以后,會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng),嚴(yán)重影響到移植手術(shù)的效果。尋找新的抑制移植排斥反應(yīng)的方法是當(dāng)今醫(yī)學(xué)面臨的重要問題之一,本課題利用異基因大鼠異位心臟移植模型,研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對移植心臟存活的影響及其對心臟移植大鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用。方法:1.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的分離、培養(yǎng):取10只Wistar大鼠在無菌條件下取其股骨、下肢脛骨骨髓,用含體積分?jǐn)?shù)為15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液對骨髓腔進(jìn)行反復(fù)沖洗,收集骨髓沖洗液并反復(fù)抽吸吹打獲得單細(xì)胞懸液,用注射器回收細(xì)胞懸液于10ml離心管中,離心后去上清,將沉淀通過含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重新懸浮,然后添加密度為1.085g/ml的Ficoll淋巴細(xì)胞分離液,離心分層,取出乳白色單個核細(xì)胞層,由包含15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行重新懸浮,在25cm~2塑料培養(yǎng)瓶容器內(nèi)進(jìn)行接種,放置在37℃環(huán)境內(nèi),含量為5%CO_2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),約2天后更換培養(yǎng)液,以后每周換液2次,借助倒置顯微鏡設(shè)備進(jìn)行觀察,當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)80%融合,此時開始傳代培養(yǎng),獲得第4-6代細(xì)胞備用。2.MSCs的鑒定:根據(jù)細(xì)胞自我更新增殖能力、形態(tài)特征及細(xì)胞表面標(biāo)志對MSCs進(jìn)行鑒定。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖和形態(tài);細(xì)胞免疫化學(xué)染色及流式細(xì)胞儀檢測MSCs表面CD29、CD90、CD34和CD45表達(dá)。3.MSCs移植:在心臟移植術(shù)前一周對實驗組受者Wistar大鼠通過尾靜脈注射MSCs,每只大鼠注射2×10~5個MSCs(0.5m L),隔天注射一次,心臟移植當(dāng)天和移植后3天繼續(xù)注射MSCs。對照組注射等劑量氯化鈉注射液。4.制備心臟異位移植大鼠模型:Lewis大鼠20只作為供體,Wistar大鼠和20只作為受體,采用套管法建立大鼠頸部心臟移植模型。手術(shù)分離取出Lewis大鼠的心臟,將其升主動脈和肺動脈根部分離,用50U/ml的O-4℃肝素生理鹽水對管腔沖洗,通過腦棉包裹心臟備用。分離Wistar大鼠頸外靜脈和頸總動脈并于遠(yuǎn)端切斷、結(jié)扎并用血管穿刺管外鞘管進(jìn)行固定。將供心主動脈與受體右頸總動脈吻合固定,將供心肺動脈與受體右頸外靜脈吻合固定,移植心臟位于右側(cè)頸部皮下,每日觀察大鼠心跳、精神狀態(tài)。手術(shù)48小時之后,如果移植心臟停跳,手術(shù)不成功。如果移植心臟跳動48h以上,即可視為模型建立成功。5.細(xì)胞因子IL-2、IL-10和T細(xì)胞亞群檢測:心臟移植術(shù)后7d,采用ELISA法檢測MSCs注射組和對照組大鼠血清白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素10表達(dá)水平,流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠血液中T細(xì)胞亞群在淋巴細(xì)胞中所占比例。6.移植心臟存活時間及病理組織學(xué)觀察:術(shù)后7d實驗組和對照組各取一半大鼠,處死后對移植心臟進(jìn)行病理學(xué)觀察;另一半大鼠繼續(xù)觀察移植心臟存活天數(shù),每日觀察大鼠精神狀態(tài),按時觸診移植心臟,觀察移植心臟搏動幅度、節(jié)律及速度。結(jié)果:1.MSCs形態(tài)、增殖和細(xì)胞表面標(biāo)志檢測:骨髓單個核細(xì)胞培養(yǎng)1-3d細(xì)胞逐漸貼壁、由圓形向多角形過渡,傳2-3代后細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)典型的扁平、貼壁、長索狀或多角形;細(xì)胞增殖明顯,每3天傳代一次,隨傳代次數(shù)增加,細(xì)胞形態(tài)均一度增強(qiáng);收集傳4-6代細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志檢測。結(jié)果顯示:MSCs CD29、CD90表達(dá)陽性率分別為98.42%、97.73%,而CD34和CD45表達(dá)陽性率分別為1.35%、2.52%,符合骨髓MSCs的特征。2.MSCs對移植心臟存活時間的影響:對兩組的術(shù)后移植心臟存活時間進(jìn)行統(tǒng)計和比較,結(jié)果顯示:MSCs注射組心臟存活時間為(14.25±2.15)d,顯著長于對照組(7.15±1.35)d,P0.05。3.MSCs對心臟移植大鼠IL-2、IL-10和T細(xì)胞亞群的影響:術(shù)后7d,ELISA法檢測分別心臟+MSC移植組和心臟移植組大鼠的血清白介素2、白介素10表達(dá)水平,兩組白介素2水平分別是248.15±25.23 pg/ml、230.25±20.35 pg/ml,二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。但心臟+MSC移植組的血清白介素10為160.23±18.75 pg/ml,顯著高于心臟移植組(80.25±12.26 pg/ml),P0.05。術(shù)后7d,對兩組大鼠血中T細(xì)胞亞群在淋巴細(xì)胞中所占比例進(jìn)行檢測和比較,發(fā)現(xiàn)心臟+MSC移植組的CD4~+、CD4~+/CD8~+、CD4~+CD25~(high)、CD4~+CD25~(high)Foxp3~+所占比例均顯著高于心臟移植組,P0.05。4.移植心臟的組織病理學(xué)觀察:術(shù)后7d獲得移植心臟組織標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),未注射MSC的心臟移植組的心肌組織有淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞大量浸潤現(xiàn)象,末梢小血管內(nèi)血栓形成等超急性排斥反應(yīng)的特征病變,存在明顯的心肌間質(zhì)水腫、出血,存在不同程度的心肌黏液性壞死和心肌細(xì)胞變性壞死。而心臟+MSC移植組的心肌組織中存在少量的淋巴細(xì)胞浸潤,出現(xiàn)灶性心肌細(xì)胞損害,心肌間質(zhì)可觀察到輕微出血和水腫,較之心臟移植組炎性反應(yīng)程度較輕。結(jié)論:對接受心臟移植的大鼠實施骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療可延長術(shù)后心臟移植物的存活時間。MSCs有可能通過調(diào)節(jié)大鼠的免疫功能,對器官移植排斥反應(yīng)發(fā)揮一定抑制作用。
【圖文】：

材料與方法后在分支處切斷、結(jié)扎。然后在其頸外靜脈近心端于遠(yuǎn)端切斷、結(jié)扎，在其末尾處利用牽引線在 16G脈，再通過顯微鑷夾翻轉(zhuǎn)血管，使其位于 16G 血管進(jìn)行固定，可通過 6-0 絲線環(huán)進(jìn)行。其次再進(jìn)行頸總右邊胸鎖乳突肌進(jìn)行切斷，并結(jié)扎，再根據(jù)以上方刺管外鞘管。

圖 2.2 供體大鼠心臟離體后修理鼠右邊頸部位置放置通過包裹在腦棉里的，確保供心放置位置與切口相符，然后通過鼠 2 根血管進(jìn)行觀察，，確保其通暢。然后再在其中插進(jìn)受體大鼠的頸總動脈套管，結(jié)扎。并采用相同方法，讓供體肺動脈相連于首先放開靜脈，之后再放開動脈，然后在漸轉(zhuǎn)換成復(fù)跳，再經(jīng)過 5-10min 之后，即可進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整，避免其血管彎曲受到壓迫合。大鼠在 15-30min 后就能行動，手術(shù)后不(70±15)min，而在手術(shù)過程中，冷缺血時
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R654.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2610175