Microarray分析BMSCs-ASCs聯(lián)合移植修復(fù)脊髓損傷的分子機(jī)制

發(fā)布時(shí)間：2020-03-28 22:07

【摘要】：【目的】本研究團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)聯(lián)合激活態(tài)雪旺細(xì)胞(Activated Schwann cells,ASCs)移植修復(fù)脊髓損傷(Spinal Cord Injury,SCI),效果顯著,其原因在于改善局部損傷微環(huán)境,但具體作用機(jī)制不明。本實(shí)驗(yàn)采用基因芯片(Microarray)技術(shù)篩選BMSCs聯(lián)合ASCs移植后,局部損傷組織中的差異表達(dá)基因。通過對差異基因的生物信息學(xué)分析,找到細(xì)胞聯(lián)合移植治療脊髓損傷的內(nèi)在作用機(jī)制,找到關(guān)鍵基因以及重要通路,為進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)胞移植修復(fù)脊髓損傷策略和臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供理論依據(jù)�！痉椒ā�1.移植種子細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定:采用骨髓腔沖洗分離培養(yǎng)大鼠BMSCs,并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測胞膜表面分子鑒定BMSCs。應(yīng)用坐骨神經(jīng)預(yù)損傷激活和膠原酶消化分離培養(yǎng)SCs,采用S100免疫熒光染色鑒定SCs。2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分類:4周齡雄性Wistar大鼠10只,體重在(80±10)g之間,用于提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和雪旺細(xì)胞,且用于移植的兩種細(xì)胞來源于同一老鼠。8周齡健康成年Wistar雌性大鼠54只,體重在(200±30)g之間,用于細(xì)胞移植后基因芯片檢測,將大鼠隨機(jī)分為6組(每組9只):A組DMEM對照7天組;B組DMEM對照14天組;C組DMEM對照28天組;D組BMSC聯(lián)合ASC移植7天組;E組BMSC聯(lián)合ASC移植14天組;F組BM-SC聯(lián)合ASC移植28天組。3.SCI動(dòng)物模型建立及細(xì)胞移植:采用成年雌性Wistar大鼠,利用NYU ImpactorII型打擊裝置建立胸10節(jié)段脊髓挫傷模型,打擊重量為l0g,高度為2.5 cm。在損傷后7天,使用Hamilton微量注射器分別將DMEM,ASCs與BMSCs混合懸液緩慢注射入脊髓損傷區(qū)域,注射劑量為每只15μL,每只動(dòng)物移植的細(xì)胞總數(shù)共3.0×10~5個(gè),注射時(shí)間5-10min。為防止細(xì)胞倒流,留針5min。分別在移植后7天,14天,28天行心臟灌注,取出損傷區(qū)域0.5 cm組織。4.生物信息學(xué)學(xué)分析:在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)將大鼠斷頭處死,切取傷段脊髓標(biāo)本,使用Trizol抽提RNA。使用所提取的RNA合成cDNA,合成并擴(kuò)增cRNA,然后進(jìn)行cRNA的純化,繼而進(jìn)行芯片雜交、芯片掃描,最后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,按照差異倍數(shù)大于2,p小于0.05標(biāo)準(zhǔn),得出相應(yīng)差異基因。對差異基因分別進(jìn)行GO功能富集分析與KEGG通路分析。【結(jié)果】成功繪制出BMSCs聯(lián)合ASCs細(xì)胞聯(lián)合移植修復(fù)脊髓損傷微環(huán)境的差異基因表達(dá)譜,細(xì)胞聯(lián)合移植后7天組差異基因一共44個(gè),其中上調(diào)基因的為20個(gè),下調(diào)基因的為24個(gè);細(xì)胞聯(lián)合移植后14天組差異基因606個(gè),上調(diào)的為386個(gè),下調(diào)的為218個(gè);細(xì)胞聯(lián)合移植后28天組得到的差異基因數(shù)分別為50個(gè),其中上調(diào)及下調(diào)的基因數(shù)分別為23個(gè)、27個(gè)。【結(jié)論】1.通過生物信息學(xué)分析篩選與脊髓損傷修復(fù)相關(guān)的部分關(guān)鍵基因。其中,Ppp1r12a、Npc1和Ngb基因達(dá)差異顯著,且與抑制細(xì)胞凋亡,改善局部微環(huán)境相關(guān),Nrsn1、Cyp26a1 Mmp12基因與促進(jìn)軸突再生、促進(jìn)突觸重塑相關(guān),S100A8/A9基因調(diào)節(jié)體內(nèi)細(xì)胞增殖和凋亡、炎癥反應(yīng)相關(guān)。2.植后7天,動(dòng)物體內(nèi)發(fā)生這抑制炎癥免疫反應(yīng)、抗凋亡等生物學(xué)過程,移植后14天,細(xì)胞聯(lián)合治療中期階段,動(dòng)物體內(nèi)主要發(fā)生的著軸突再生,突觸重塑等生物學(xué)過程質(zhì),移植后28天,動(dòng)物體內(nèi)出現(xiàn)新的蛋白的再生,細(xì)胞的復(fù)制等。
【圖文】：

熒光顯微鏡