【摘要】：體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass,CPB)是心內直視手術的一種重要手段,隨著CPB技術、心肌保護措施和心臟外科手術技巧不斷完善與提高,心內直視手術的并發(fā)癥發(fā)生率和病死率逐步下降。然而,肺損傷仍是CPB術后的主要并發(fā)癥之一。Nature雜志于21世紀初首次提到以迷走神經(jīng)及其主要遞質乙酞膽堿(Ach)構成的神經(jīng)-免疫調節(jié)通路,即-膽堿能抗炎通路(Cholinergic Anti-infammatory Pathway CAP)。CAP是一種內源性的神經(jīng)反饋調節(jié)通路,當機體受到損害性刺激而引發(fā)炎癥反應時,迷走神經(jīng)釋放Ach至外周組織,Ach與巨噬細胞或其他免疫細胞表面相應受體相結合,通過調節(jié)機體內部一系列病理生理反應,而發(fā)揮抗炎作用。在此過程中,Ach主要作用于煙堿型乙酞膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)和毒覃堿型乙酞膽堿受體(muscarinicacetylcho-linereceptor,m AChR),兩者主要分布于迷走神經(jīng)效應細胞表面,分別受配體門控離子通道受體家族和G-蛋白藕聯(lián)受體家族的調控。κ-阿片受體(kappa opioid receptor,KOR)由380個氨基酸組成,是阿片類受體的一類亞型,屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族,主要分布于中樞神經(jīng)組織,經(jīng)原位雜交法檢測發(fā)現(xiàn)在大鼠海馬齒狀回、下丘腦、某些丘腦核團以及大腦皮層、尾狀核、嗅球、伏隔核和脊髓等部位均存在κ-阿片受體的mRNA,并且發(fā)現(xiàn)在肺迷走神經(jīng)部位也存在κ-阿片受體。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)它們不僅有著良好的鎮(zhèn)痛活性,且無呼吸抑制、成癮性、便秘、耐受性等μ阿片受體樣副作用,還能夠對抗μ阿片受體激動后引起的藥物依賴性。目前已證明κ-激動劑能明顯改善μ-激動劑導致的記憶損害,其作用不僅與μ-受體激動劑作用相反,并且能調節(jié)μ受體的作用,如抗傷害作用,對體溫的影響,對伏隔核多巴胺釋放的影響以及對脊髓中甲硫腦啡肽樣物質釋放的影響等,但是目前對于κ-阿片受體激動劑對肺損傷的作用暫不明確。本研究除從細胞、分子和基因水平上探討CPB對肺上皮屏障功能損傷的機制外,還將進一步探討κ-阿片受體對CPB后肺上皮屏障保護的可行性。旨在為其臨床應用提供實驗依據(jù),亦為臨床減少CPB手術后急性肺損傷的發(fā)生率提供有效的防治措施。實驗材料與方法實驗材料1、實驗動物:健康雄性SD大鼠,體重400~500g。2、主要試劑及藥品:TNF-α、IL-6、IL-10免疫組化試劑盒(天津九鼎醫(yī)學生物工程有限公司),水合氯醛(上海化學試劑采購供應站分裝廠);α7nAChR抗體(Santa Cruz Biotechnology),MPO、MDA、SOD(南京建成生物工程研究所)。3、主要儀器:高速離心機(TDL-SA);三用電熱恒溫水浴箱(DH)-600);多功能振蕩器;倒置顯微鏡(OLYMPUS-Ix70 Model,Japan);RX-2000型全自動生化分析儀(美國Technicon公司);TKR-200C小動物呼吸機(江蘇特力麻醉呼吸設備公司);特制微型膜肺(廣東科威醫(yī)療器械有限公司提供采);小型蠕動泵(保定蘭格恒流泵有限公司,BT002300M型)。實驗方法1、大鼠CPB的建立取雄性SD大鼠,以10%水合氯醛350 mg·kg~(-1)腹腔內注射麻醉,氣管插管接小動物呼吸機輔助呼吸。通過微型化CPB環(huán)路設備,經(jīng)右頸靜脈腔房引流、左頸動脈灌注,方法建立大鼠開胸停跳CPB模型。2、實驗分組SD大鼠56只隨機分為SH、CPB、CPB+Ach、CPB+U50488、CPB+U50488SH+THAG2五組,CPB組24只,其余每組8只。SH組:為假手術對照組(Sham-operated group,SH),大鼠只在相應部位插管,但不進行CPB轉流。CPB組:設主動脈開放組,CPB60min結束時和停CPB后2h時三個相點。CPB+Ach、CPB+U50488、CPB+U50488SH+THAG2組:各組大鼠在手術開始之前給予相應的預處理因素。3、觀察指標和檢測方法(1)大鼠血管外肺水含量測定;(2)肺組織MDA、MPO和SOD濃度的變化;(3)血漿IL-6、IL-10、TNF α、LPS和MMP-9的變化;(4)HE和透射電鏡觀察肺組織形態(tài)學變化;(5)肺組織α7-nAChR蛋白和mRNA的表達。實驗結果一、各組大鼠肺上皮屏障功能的變化CPB組大鼠的EVLW、血漿LPS濃度及MMP9濃度均增加,差異具有統(tǒng)計學意義,提示CPB后,大鼠的炎癥反應增加、肺上皮功能受損。二、肺組織MDA、MPO和SOD水平變化CPB組肺組織MDA、MPO濃度明顯升高,SOD濃度明顯降低,與SH組相比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);而給予阿片受體激動劑U50488后,氧化應激的水平有所緩解,給予抗膽堿能通路激動劑及抑制劑后,U50488的這種作用受到增強和抑制。二、血漿TNF-a、IL-6和IL-10水平變化CPB組血漿TNF-a、IL-6濃度明顯升高,IL-10濃度明顯降低,與SH組相比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);而給予阿片受體激動劑U50488后,炎癥反應狀態(tài)有所緩解,給予抗膽堿能通路激動劑及抑制劑后,U50488的這種作用受到增強和抑制。三、各組大鼠肺組織形態(tài)學改變1、HE染色光鏡觀察SH組大鼠肺組織結構完整,肺泡腔清晰,肺泡間隔無水腫,CPB2h組肺泡壁明顯增厚,肺泡內充血/出血,大量炎性細胞浸潤,而給予阿片受體激動劑U50488后,炎癥反應狀態(tài)有所緩解,給予抗膽堿能通路激動劑及抑制劑后,U50488的這種作用受到增強和抑制。2、透射電鏡觀察SH組肺組織超微結構基本正常,血管內皮細胞形態(tài)結構正常;CPB2h組肺組織超微結構明顯受損,氣血屏障結構模糊,水腫增厚,部分肺泡上皮細胞缺損,血管內皮基底膜斷裂,線粒體結構破壞呈空泡狀改變,板層小體排空。而給予阿片受體激動劑U50488后,炎癥反應狀態(tài)有所緩解,給予抗膽堿能通路激動劑及抑制劑后,U50488的這種作用受到增強和抑制。四、肺組織α7nAChR蛋白表達變化與肺上皮屏障功能的關系肺組織α7nAChR蛋白表達與大鼠的EVLW、血漿LPS濃度、MMP9濃度、MDA、MPO濃度呈負相關,與血漿SOD濃度呈正相關。五、給予α7-nAChR激動劑后,各組炎癥通路的變化給予抗膽堿能通路激動劑Ach后,CPB+Ach組血漿TNF-a、IL-6水平明顯低于CPB組,NF-κB的含量也明顯低于CPB組,差異有統(tǒng)計學意義;而大鼠EVLW明顯低于CPB組,差異有統(tǒng)計學意義。結論1、CPB后大鼠EVLW、血漿LPS、MMP-9水平明顯升高,是肺上皮屏障功能受損的重要機制。2、CPB后肺上皮中a7n AchR蛋白及mRNA減少,可能是CPB引起大鼠肺上皮屏障功能障礙的機制之一。3、CPB后全身炎癥反應是引起肺上皮屏障功能障礙的重要因素,并在全身性損害中起重要作用。a7nAchR與肺損傷的程度、炎癥反應及NF-κB通路具有相關性,可能是a7nAchR參與調節(jié)CPB后肺損傷的機制之一。4、κ-阿片受體預處理可以減輕CPB后缺血再灌注損傷和全身炎性反應程度,降低肺泡上皮的通透性,對肺上皮屏障起到一定的保護作用,這種作用存在一定劑量的依賴性。5、κ-阿片受體預處理保護肺上皮屏障功能,可能通過激活CAP-NF-κB信號通路,啟動內源性保護機制,抗氧化損傷、調節(jié)炎癥反應等途徑實現(xiàn)。
【圖文】：

中國醫(yī)科大學博士學位論文3ml/100g，頻率 60/min，吸呼比 1：1.5，，氣道峰壓維持在 9.0cmH2O。麻醉間斷腹腔注射水合氯醛 0.15g/3彛暇猜鱟⑸溥嚦憮屣

本文編號：2599755