【摘要】：體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass,CPB)是心內(nèi)直視手術(shù)的一種重要手段,隨著CPB技術(shù)、心肌保護(hù)措施和心臟外科手術(shù)技巧不斷完善與提高,心內(nèi)直視手術(shù)的并發(fā)癥發(fā)生率和病死率逐步下降。然而,肺損傷仍是CPB術(shù)后的主要并發(fā)癥之一。Nature雜志于21世紀(jì)初首次提到以迷走神經(jīng)及其主要遞質(zhì)乙酞膽堿(Ach)構(gòu)成的神經(jīng)-免疫調(diào)節(jié)通路,即-膽堿能抗炎通路(Cholinergic Anti-infammatory Pathway CAP)。CAP是一種內(nèi)源性的神經(jīng)反饋調(diào)節(jié)通路,當(dāng)機(jī)體受到損害性刺激而引發(fā)炎癥反應(yīng)時(shí),迷走神經(jīng)釋放Ach至外周組織,Ach與巨噬細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞表面相應(yīng)受體相結(jié)合,通過調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)部一系列病理生理反應(yīng),而發(fā)揮抗炎作用。在此過程中,Ach主要作用于煙堿型乙酞膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)和毒覃堿型乙酞膽堿受體(muscarinicacetylcho-linereceptor,m AChR),兩者主要分布于迷走神經(jīng)效應(yīng)細(xì)胞表面,分別受配體門控離子通道受體家族和G-蛋白藕聯(lián)受體家族的調(diào)控。κ-阿片受體(kappa opioid receptor,KOR)由380個(gè)氨基酸組成,是阿片類受體的一類亞型,屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族,主要分布于中樞神經(jīng)組織,經(jīng)原位雜交法檢測發(fā)現(xiàn)在大鼠海馬齒狀回、下丘腦、某些丘腦核團(tuán)以及大腦皮層、尾狀核、嗅球、伏隔核和脊髓等部位均存在κ-阿片受體的mRNA,并且發(fā)現(xiàn)在肺迷走神經(jīng)部位也存在κ-阿片受體。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)它們不僅有著良好的鎮(zhèn)痛活性,且無呼吸抑制、成癮性、便秘、耐受性等μ阿片受體樣副作用,還能夠?qū)功贪⑵荏w激動(dòng)后引起的藥物依賴性。目前已證明κ-激動(dòng)劑能明顯改善μ-激動(dòng)劑導(dǎo)致的記憶損害,其作用不僅與μ-受體激動(dòng)劑作用相反,并且能調(diào)節(jié)μ受體的作用,如抗傷害作用,對(duì)體溫的影響,對(duì)伏隔核多巴胺釋放的影響以及對(duì)脊髓中甲硫腦啡肽樣物質(zhì)釋放的影響等,但是目前對(duì)于κ-阿片受體激動(dòng)劑對(duì)肺損傷的作用暫不明確。本研究除從細(xì)胞、分子和基因水平上探討CPB對(duì)肺上皮屏障功能損傷的機(jī)制外,還將進(jìn)一步探討κ-阿片受體對(duì)CPB后肺上皮屏障保護(hù)的可行性。旨在為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),亦為臨床減少CPB手術(shù)后急性肺損傷的發(fā)生率提供有效的防治措施。實(shí)驗(yàn)材料與方法實(shí)驗(yàn)材料1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康雄性SD大鼠,體重400~500g。2、主要試劑及藥品:TNF-α、IL-6、IL-10免疫組化試劑盒(天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司),水合氯醛(上�；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站分裝廠);α7nAChR抗體(Santa Cruz Biotechnology),MPO、MDA、SOD(南京建成生物工程研究所)。3、主要儀器:高速離心機(jī)(TDL-SA);三用電熱恒溫水浴箱(DH)-600);多功能振蕩器;倒置顯微鏡(OLYMPUS-Ix70 Model,Japan);RX-2000型全自動(dòng)生化分析儀(美國Technicon公司);TKR-200C小動(dòng)物呼吸機(jī)(江蘇特力麻醉呼吸設(shè)備公司);特制微型膜肺(廣東科威醫(yī)療器械有限公司提供采);小型蠕動(dòng)泵(保定蘭格恒流泵有限公司,BT002300M型)。實(shí)驗(yàn)方法1、大鼠CPB的建立取雄性SD大鼠,以10%水合氯醛350 mg·kg~(-1)腹腔內(nèi)注射麻醉,氣管插管接小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸。通過微型化CPB環(huán)路設(shè)備,經(jīng)右頸靜脈腔房引流、左頸動(dòng)脈灌注,方法建立大鼠開胸停跳CPB模型。2、實(shí)驗(yàn)分組SD大鼠56只隨機(jī)分為SH、CPB、CPB+Ach、CPB+U50488、CPB+U50488SH+THAG2五組,CPB組24只,其余每組8只。SH組:為假手術(shù)對(duì)照組(Sham-operated group,SH),大鼠只在相應(yīng)部位插管,但不進(jìn)行CPB轉(zhuǎn)流。CPB組:設(shè)主動(dòng)脈開放組,CPB60min結(jié)束時(shí)和停CPB后2h時(shí)三個(gè)相點(diǎn)。CPB+Ach、CPB+U50488、CPB+U50488SH+THAG2組:各組大鼠在手術(shù)開始之前給予相應(yīng)的預(yù)處理因素。3、觀察指標(biāo)和檢測方法(1)大鼠血管外肺水含量測定;(2)肺組織MDA、MPO和SOD濃度的變化;(3)血漿IL-6、IL-10、TNF α、LPS和MMP-9的變化;(4)HE和透射電鏡觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化;(5)肺組織α7-nAChR蛋白和mRNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果一、各組大鼠肺上皮屏障功能的變化CPB組大鼠的EVLW、血漿LPS濃度及MMP9濃度均增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示CPB后,大鼠的炎癥反應(yīng)增加、肺上皮功能受損。二、肺組織MDA、MPO和SOD水平變化CPB組肺組織MDA、MPO濃度明顯升高,SOD濃度明顯降低,與SH組相比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而給予阿片受體激動(dòng)劑U50488后,氧化應(yīng)激的水平有所緩解,給予抗膽堿能通路激動(dòng)劑及抑制劑后,U50488的這種作用受到增強(qiáng)和抑制。二、血漿TNF-a、IL-6和IL-10水平變化CPB組血漿TNF-a、IL-6濃度明顯升高,IL-10濃度明顯降低,與SH組相比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而給予阿片受體激動(dòng)劑U50488后,炎癥反應(yīng)狀態(tài)有所緩解,給予抗膽堿能通路激動(dòng)劑及抑制劑后,U50488的這種作用受到增強(qiáng)和抑制。三、各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)改變1、HE染色光鏡觀察SH組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整,肺泡腔清晰,肺泡間隔無水腫,CPB2h組肺泡壁明顯增厚,肺泡內(nèi)充血/出血,大量炎性細(xì)胞浸潤,而給予阿片受體激動(dòng)劑U50488后,炎癥反應(yīng)狀態(tài)有所緩解,給予抗膽堿能通路激動(dòng)劑及抑制劑后,U50488的這種作用受到增強(qiáng)和抑制。2、透射電鏡觀察SH組肺組織超微結(jié)構(gòu)基本正常,血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常;CPB2h組肺組織超微結(jié)構(gòu)明顯受損,氣血屏障結(jié)構(gòu)模糊,水腫增厚,部分肺泡上皮細(xì)胞缺損,血管內(nèi)皮基底膜斷裂,線粒體結(jié)構(gòu)破壞呈空泡狀改變,板層小體排空。而給予阿片受體激動(dòng)劑U50488后,炎癥反應(yīng)狀態(tài)有所緩解,給予抗膽堿能通路激動(dòng)劑及抑制劑后,U50488的這種作用受到增強(qiáng)和抑制。四、肺組織α7nAChR蛋白表達(dá)變化與肺上皮屏障功能的關(guān)系肺組織α7nAChR蛋白表達(dá)與大鼠的EVLW、血漿LPS濃度、MMP9濃度、MDA、MPO濃度呈負(fù)相關(guān),與血漿SOD濃度呈正相關(guān)。五、給予α7-nAChR激動(dòng)劑后,各組炎癥通路的變化給予抗膽堿能通路激動(dòng)劑Ach后,CPB+Ach組血漿TNF-a、IL-6水平明顯低于CPB組,NF-κB的含量也明顯低于CPB組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而大鼠EVLW明顯低于CPB組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論1、CPB后大鼠EVLW、血漿LPS、MMP-9水平明顯升高,是肺上皮屏障功能受損的重要機(jī)制。2、CPB后肺上皮中a7n AchR蛋白及mRNA減少,可能是CPB引起大鼠肺上皮屏障功能障礙的機(jī)制之一。3、CPB后全身炎癥反應(yīng)是引起肺上皮屏障功能障礙的重要因素,并在全身性損害中起重要作用。a7nAchR與肺損傷的程度、炎癥反應(yīng)及NF-κB通路具有相關(guān)性,可能是a7nAchR參與調(diào)節(jié)CPB后肺損傷的機(jī)制之一。4、κ-阿片受體預(yù)處理可以減輕CPB后缺血再灌注損傷和全身炎性反應(yīng)程度,降低肺泡上皮的通透性,對(duì)肺上皮屏障起到一定的保護(hù)作用,這種作用存在一定劑量的依賴性。5、κ-阿片受體預(yù)處理保護(hù)肺上皮屏障功能,可能通過激活CAP-NF-κB信號(hào)通路,啟動(dòng)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制,抗氧化損傷、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等途徑實(shí)現(xiàn)。
【圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3ml/100g，頻率 60/min，吸呼比 1：1.5，，氣道峰壓維持在 9.0cmH2O。麻醉間斷腹腔注射水合氯醛 0.15g/3�，联合静瞒c⑸溥嚦憮屣

本文編號(hào)：2599755