【摘要】：[目的]探討移植皮膚成纖維細(xì)胞治療糖尿病小鼠創(chuàng)面的效果及其可能機制,探討糖尿病皮膚成纖維細(xì)胞離體培養(yǎng)后的活性改變,為今后臨床應(yīng)用皮膚成纖維細(xì)胞治療糖尿病創(chuàng)面奠定基礎(chǔ)及提供理論依據(jù)。[方法]糖尿病個體模型選用10～12周齡自發(fā)基因突變糖尿病小鼠(DB/DB),正常個體模型選用正常小鼠(DB/+),各取20只以組織塊培養(yǎng)法提取DMsFb(糖尿病皮膚成纖維細(xì)胞)、NsFb(正常皮膚成纖維細(xì)胞)。取27只6～8周齡糖尿病小鼠,在其背部復(fù)制1cm*1cm全層皮膚缺損,并按隨機數(shù)字表法分成A、PBS對照組(局部注射PBS于DB/DB小鼠創(chuàng)面四個創(chuàng)緣內(nèi));B、DMsFb治療組(局部注射DMsFb于DB/DB小鼠創(chuàng)面四個創(chuàng)緣內(nèi));C、NsFb治療組(局部注射NsFb于DB/DB小鼠創(chuàng)面四個創(chuàng)緣內(nèi));每組9只,分別進(jìn)行開放創(chuàng)面大小測量、創(chuàng)面換藥、圖像采集、創(chuàng)面愈合率計算,時間節(jié)點取傷后第3、第7、第10、第14、第17天。于傷后第7、14天進(jìn)行創(chuàng)面取材,免疫熒光法檢測創(chuàng)面組織細(xì)胞增殖情況(Ki67表達(dá))、免疫組化法檢測創(chuàng)面組織新生血管形成率(MVD蛋白表達(dá))、馬松染色檢測創(chuàng)面組織膠原沉積情況、Annexin-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測離體培養(yǎng)后的DMsFb及NsFb細(xì)胞凋亡率、RT-PCR檢測離體培養(yǎng)后的細(xì)胞TGF-β1、AGEs、MMP-9、NK-1的mRNA表達(dá)水平、蛋白質(zhì)印跡法檢測離體培養(yǎng)后的細(xì)胞TGF-β1、AGEs、MMP-9、NK-1的蛋白量表達(dá)水平,探尋其發(fā)生作用的可能機制。對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析。[結(jié)果]1)傷后各時相點DMsFb治療組、NsFb治療組均較PBS對照組愈合快,但傷后17天NsFb治療組與PBS對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);除傷后第3天、第10天外,其余各時相點DMsFb治療組創(chuàng)面愈合均較NsFb治療組緩慢(P0.05)。2)傷后7、14天,相較PBS對照組而言,NsFb治療組及DMsFb治療組創(chuàng)面的Ki67增殖指數(shù)均表達(dá)為明顯高水平,比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);而傷后7、14天,NsFb治療組創(chuàng)面Ki67增殖指數(shù)均高于DMsFb治療組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);三個組傷后14天創(chuàng)面Ki67增殖指數(shù)均較傷后7天增高,差異比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。3)傷后7、14天NsFb治療組、DMsFb治療組創(chuàng)面MVD蛋白表達(dá)均高于PBS對照組,比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);DMsFb治療組創(chuàng)面MVD蛋白表達(dá)低于NsFb治療組,差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);三個組較傷后7天創(chuàng)面MVD蛋白表達(dá)均低于傷后14天,比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。4)馬松染色法結(jié)果顯示傷后7、14天NsFb治療組創(chuàng)面膠原沉積量均高于DMsFb治療組及PBS對照組,比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);而DMsFb治療組創(chuàng)面膠原沉積量較PBS對照組稍增,差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);三個組傷后14天創(chuàng)面膠原沉積量均較傷后7天增高,差異比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。5)對細(xì)胞活性發(fā)現(xiàn),DMsFb細(xì)胞凋亡率較NsFb明顯增高,相較未經(jīng)脫離糖尿病環(huán)境離體培養(yǎng)的DMsFb P0而言,經(jīng)離體培養(yǎng)純化后的DMsFb P4細(xì)胞凋亡率尚無明顯改善;NsFb P0的TGF-β1及NK-1 mRNA較DMsFb P0呈明顯高水平,而DMsFb P4的NK-1 mRNA較DMsFbPO呈下調(diào)趨勢,差異比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。NsFbPO的 AGEs 及 MMP-9 mRNA 較 DMsFb 呈明顯低表達(dá),而 DMsFb P4 AGEs mRNA則較DMsFb PO顯著降低,比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);蛋白印跡法顯示各組細(xì)胞相應(yīng)蛋白量表達(dá)趨勢與mRNA表達(dá)趨勢基本相符。[結(jié)論]于糖尿病小鼠創(chuàng)面四個創(chuàng)緣內(nèi)局部注射NsFb/DMsFb后,較PBS對照組而言,兩治療組創(chuàng)面在愈合進(jìn)程中的細(xì)胞增殖指數(shù)(Ki67)、新生血管形成率(MVD蛋白)、膠原沉積等檢測指標(biāo)均有顯著改善,同時對NsFb/DMsFb細(xì)胞活性檢測發(fā)現(xiàn),DMsFb P4 AGEs mRNA較DMsFb P0顯著降低,推測可將DMsFb脫離糖尿病這一高糖微環(huán)境進(jìn)行體外培養(yǎng)傳代純化使其細(xì)胞功能活性在一定程度上恢復(fù)正常,從而在細(xì)胞增殖、新生血管形成、膠原沉積、細(xì)胞因子介導(dǎo)等方面改善慢性創(chuàng)面愈合進(jìn)展,在不同時間點上提高糖尿病小鼠的創(chuàng)面愈合率。因此,對糖尿病創(chuàng)面施行局部移植sFb可能早期創(chuàng)面修復(fù)進(jìn)程中起著一定的促進(jìn)作用,這可為今后臨床對慢性創(chuàng)面施行sFb細(xì)胞治療奠定基礎(chǔ),提供理論依據(jù)。
【圖文】：

＜０．０５）；而傷后各時相點ＤＭｓＦｂ治療組較ＰＢＳ對照組愈合快，比較差異有統(tǒng)逡逑計學(xué)意義（Ｐ＜0．0５）；傷后各時相點ＤＭｓＦｂ治療組愈合均較ＮｓＦｂ治療組稍顯緩逡逑慢，但僅有傷后７天差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ＜０．０５）。見表１，圖１、２。逡逑表１糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合率（％，ｘ±ｓ）逡逑傷后天數(shù)邐Ｎ邐３邐７邐１０邐１４邐１７逡逑ＰＢＳ邋對照組邐９邐５．５９±０．４８邐２４．８０±１．４４邐４９．７１±０．３９邐７９．４２±１．３７邐９４．０１±１．４５逡逑ＤＭｓＦｂ邋治邐９邐９．７８±０．７５邐３８．９６±１．０２邐７７．０３±１．６０邐９５．０５士０．９８邐９７．９９±０．８１逡逑療組逡逑ＮｓＦｂ邋治療邋９邐９．８３±０．０８邐４１．７７±０．６３邐７９．１７±０．５４邐９６．９５±１．２２邐９９．３３±０．４５逡逑組逡逑ｔｌ邋值邐９．１５邐１０．２５邐３５．２８邐６．７９邐３．４５逡逑Ｐ１邋值邐０．０１邐０．０１邐０．０１邐０．０２邐０．０７逡逑ｔ２邋值邐０．０６邐４．４１邐１．１４邐４．１６邐１．９２逡逑Ｐ２邋值邐０．９５邐０．０２邐０．３７邐０．０５邐０．２逡逑ｔ３邋值邐８．３７邐１０．６９邐２２．５３邐６．７邐４．４７逡逑Ｐ３邋值邐０．００４邐０．００２邐０．００２邐０．０２２邐０．０４７逡逑注：處理因素主效應(yīng)Ｆ＝５５４０，邋Ｐ＜０．０１；時間因素主效應(yīng)Ｆ＝３２７．３，邋Ｐ＜０．０１；兩者交互作用逡逑Ｆ＝４３．５８

注：圖中標(biāo)尺每小格＝０．１ｍｍ逡逑圖２糖尿病小鼠皮膚全層缺損創(chuàng)面局部注射ＰＢＳ／ＤＭｓＦｂ／ＮｓＦｂ后的創(chuàng)面動態(tài)變逡逑化逡逑３．２創(chuàng)面組織Ｋｉ６７的表達(dá)情況逡逑各組小鼠創(chuàng)面組織采用免疫熒光法對傷后７、１４天Ｋｉ６７增殖指數(shù)情況觀察。逡逑每張切片任意取３個高倍視野同時對每個視野陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計數(shù)，按“陽性細(xì)逡逑胞率（％）＝陽性細(xì)胞數(shù)／有核細(xì)胞總數(shù)＊１00％”所求出的平均數(shù)即為每張切片陽逡逑性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果如下：逡逑傷后７、１４天，較ＰＢＳ對照組而言，ＮｓＦｂ治療組創(chuàng)面Ｋｉ６７增殖指數(shù)均呈逡逑明顯高水平，差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ＜０．０５）；傷后７、１４天，ＤＭｓＦｂ治療逡逑組創(chuàng)面Ｋｉ６７增殖指數(shù)均較ＰＢＳ對照組呈明顯高水平，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ逡逑＜０．０５）；而傷后７、１４天，ＮｓＦｂ治療組創(chuàng)面Ｋｉ６７增殖指數(shù)均較ＤＭｓＦｂ治療組逡逑
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2;R622

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2596137