【摘要】：目的:利用基因芯片技術(shù)比較分析骨肉瘤耐藥細胞與其原代細胞的基因差異表達情況,并驗證芯片結(jié)果,為開發(fā)骨肉瘤的靶向基因治療奠定基礎(chǔ)。方法:1、利用CCK 8法檢測人骨肉瘤MG63細胞和耐長春新堿MG63細胞(MG63/VCR細胞)對長春新堿的敏感性。2、采用Trizol法提取兩種細胞的總RNA作為樣品用于基因芯片檢測;利用Affymetrix公司的表達譜芯片配套試劑盒對上述總RNA中的m RNA進行放大、標(biāo)記和純化;按照基因芯片雜交、清洗和染色試劑盒,配制雜交反應(yīng)液與芯片進行雜交、洗滌;通過掃描獲得原始數(shù)據(jù),芯片結(jié)果經(jīng)過質(zhì)控處理后篩選出差異表達的基因。3、利用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)軟件對芯片結(jié)果進行生物信息學(xué)分析,預(yù)測差異基因在耐藥發(fā)展中的作用。并通過實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)對芯片結(jié)果的可靠性進行驗證。結(jié)果:1.對比長春新堿的半數(shù)藥物抑制濃度IC50,骨肉瘤多藥耐藥細胞MG63/VCR為493.175±4.473 ng/ml,原代細胞MG63為1.407±0.111 ng/ml(p0.01)。2.芯片結(jié)果顯示MG63/VCR與MG63細胞之間的差異表達基因達1300條(698條基因表達下調(diào),602條基因表達上調(diào)),進一步篩選符合差異倍數(shù)|Fold Changes|≥4,且p值0.05有統(tǒng)計學(xué)意義為標(biāo)準的45個下調(diào)基因和26個上調(diào)基因進行分析。其中轉(zhuǎn)錄因子4條,酶12條,轉(zhuǎn)運蛋白5條,跨膜受體4條,其他46條。3.芯片結(jié)果利用IPA進行生物信息學(xué)分析,預(yù)測差異表達基因主要富集在UVA-Induced MAPKSignaling(PIK3R1,MAPK9 and EGFR etc.)、Erb B2-Erb B3 Signaling(RRAS2,STAT5B,and ATM etc.)等信號通路,這些信號通路可能參與調(diào)節(jié)機體死亡、免疫細胞的死亡和化療耐藥。篩選其中10條基因(ROBO1、DAPK1和AKAP12等),利用q RT-PCR進行驗證,證實所選基因在MG63/VCR細胞和MG63細胞中確有差異表達,且90%與基因芯片的表達情況一致。結(jié)論:1.骨肉瘤耐藥細胞系MG63/VCR與原代細胞系MG63相比,對長春新堿敏感性降低,耐受性增強(p0.01)。2.通過對比分析骨肉瘤耐藥細胞與原代細胞之間的基因芯片結(jié)果,挖掘了顯著差異表達的基因,且差異表達的基因經(jīng)過驗證提示芯片結(jié)果是可信的,其中ROBO1、DAPK1、AKAP12等關(guān)聯(lián)基因可能作為骨肉瘤耐藥細胞的治療新靶點。
【圖文】：

以體外培養(yǎng)構(gòu)建的人成骨肉瘤耐藥細胞系 MG63系 MG63 為研究對象，利用 CCK-8 實驗驗證耐藥性差異情況。提取兩者細胞的總 RNA 作為基因檢后，利用 GeneChip 3’IVT Express Kit 試劑盒d RNA），經(jīng)過合成一鏈獲得 cDNA，再通過合成板，而后在體外經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄得到用生物素標(biāo)記的、片段處理，與芯片上的探針雜交。完成雜交、掃描圖像獲得原始數(shù)據(jù)，最后進行數(shù)據(jù)分析。（

圖 2.3.1 MG63 和 MG63 / VCR 細胞的抑制率曲線圖表。橫軸是 lg 藥物濃度，縱坐標(biāo)軸為抑制率。2.3.2 RNA 提取質(zhì)檢結(jié)果采用 Trizol 法從骨肉瘤耐藥細胞 MG63/VCR 及其原代細胞 MG63中提取總 RNA，將提取的 RNA 用 NanoDrop2000 和 Agilent 2100 進行質(zhì)量檢測，合格樣本進入下一步實驗。RNA 質(zhì)控-RIN 值（The RNAIntegrity Number， RIN）可完整的評估樣品的質(zhì)量， The RIN 軟件算法考慮到真核生物 RNA 分類，，分數(shù)評估為 1-10 分，設(shè)定 10 是最完整的，1 是最初級可以保障。結(jié)果如表 2.3.2 中顯示兩組樣品的總 RNA 質(zhì)量符合標(biāo)準，說明所提取的細胞的總 RNA 具備完整性。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R738

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本文編號：2595971