【摘要】：目的:利用基因芯片技術比較分析骨肉瘤耐藥細胞與其原代細胞的基因差異表達情況,并驗證芯片結果,為開發(fā)骨肉瘤的靶向基因治療奠定基礎。方法:1、利用CCK 8法檢測人骨肉瘤MG63細胞和耐長春新堿MG63細胞(MG63/VCR細胞)對長春新堿的敏感性。2、采用Trizol法提取兩種細胞的總RNA作為樣品用于基因芯片檢測;利用Affymetrix公司的表達譜芯片配套試劑盒對上述總RNA中的m RNA進行放大、標記和純化;按照基因芯片雜交、清洗和染色試劑盒,配制雜交反應液與芯片進行雜交、洗滌;通過掃描獲得原始數(shù)據(jù),芯片結果經(jīng)過質控處理后篩選出差異表達的基因。3、利用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)軟件對芯片結果進行生物信息學分析,預測差異基因在耐藥發(fā)展中的作用。并通過實時定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)對芯片結果的可靠性進行驗證。結果:1.對比長春新堿的半數(shù)藥物抑制濃度IC50,骨肉瘤多藥耐藥細胞MG63/VCR為493.175±4.473 ng/ml,原代細胞MG63為1.407±0.111 ng/ml(p0.01)。2.芯片結果顯示MG63/VCR與MG63細胞之間的差異表達基因達1300條(698條基因表達下調(diào),602條基因表達上調(diào)),進一步篩選符合差異倍數(shù)|Fold Changes|≥4,且p值0.05有統(tǒng)計學意義為標準的45個下調(diào)基因和26個上調(diào)基因進行分析。其中轉錄因子4條,酶12條,轉運蛋白5條,跨膜受體4條,其他46條。3.芯片結果利用IPA進行生物信息學分析,預測差異表達基因主要富集在UVA-Induced MAPKSignaling(PIK3R1,MAPK9 and EGFR etc.)、Erb B2-Erb B3 Signaling(RRAS2,STAT5B,and ATM etc.)等信號通路,這些信號通路可能參與調(diào)節(jié)機體死亡、免疫細胞的死亡和化療耐藥。篩選其中10條基因(ROBO1、DAPK1和AKAP12等),利用q RT-PCR進行驗證,證實所選基因在MG63/VCR細胞和MG63細胞中確有差異表達,且90%與基因芯片的表達情況一致。結論:1.骨肉瘤耐藥細胞系MG63/VCR與原代細胞系MG63相比,對長春新堿敏感性降低,耐受性增強(p0.01)。2.通過對比分析骨肉瘤耐藥細胞與原代細胞之間的基因芯片結果,挖掘了顯著差異表達的基因,且差異表達的基因經(jīng)過驗證提示芯片結果是可信的,其中ROBO1、DAPK1、AKAP12等關聯(lián)基因可能作為骨肉瘤耐藥細胞的治療新靶點。
【圖文】：

以體外培養(yǎng)構建的人成骨肉瘤耐藥細胞系 MG63系 MG63 為研究對象，利用 CCK-8 實驗驗證耐藥性差異情況。提取兩者細胞的總 RNA 作為基因檢后，利用 GeneChip 3’IVT Express Kit 試劑盒d RNA），經(jīng)過合成一鏈獲得 cDNA，再通過合成板，而后在體外經(jīng)過反轉錄得到用生物素標記的、片段處理，與芯片上的探針雜交。完成雜交、掃描圖像獲得原始數(shù)據(jù)，最后進行數(shù)據(jù)分析。（

圖 2.3.1 MG63 和 MG63 / VCR 細胞的抑制率曲線圖表。橫軸是 lg 藥物濃度，縱坐標軸為抑制率。2.3.2 RNA 提取質檢結果采用 Trizol 法從骨肉瘤耐藥細胞 MG63/VCR 及其原代細胞 MG63中提取總 RNA，將提取的 RNA 用 NanoDrop2000 和 Agilent 2100 進行質量檢測，合格樣本進入下一步實驗。RNA 質控-RIN 值（The RNAIntegrity Number， RIN）可完整的評估樣品的質量， The RIN 軟件算法考慮到真核生物 RNA 分類，，分數(shù)評估為 1-10 分，設定 10 是最完整的，1 是最初級可以保障。結果如表 2.3.2 中顯示兩組樣品的總 RNA 質量符合標準，說明所提取的細胞的總 RNA 具備完整性。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R738

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