【摘要】：目的:探索BMP-7在體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化為神經(jīng)元的作用。方法:以全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)大鼠BMSCs。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型CD29、CD44。成脂誘導(dǎo)及油紅O染色鑒定大鼠BMSCs多向分化能力。MTT法檢測(cè)濃度分別為25ng/ml、50ng/ml、75ng/ml及100ng/ml的BMP-7對(duì)大鼠BMSCs增殖的影響。倒置相差顯微鏡下觀察25ng/ml、50ng/ml、75ng/ml及100ng/ml的BMP-7誘導(dǎo)大鼠BMSCS后形態(tài)學(xué)變化,并取形態(tài)學(xué)變化最顯著的進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)得到的細(xì)胞神經(jīng)絲蛋白200(Neurofilament protein-200,NF200)、突觸蛋白1(Synaptic protein 1,SYN1)、微管相關(guān)蛋白2(Microtubule-associated protein-2,MAP2)、膠質(zhì)纖微酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)mRNA相對(duì)表達(dá)量。免疫組化檢測(cè)誘導(dǎo)得到的細(xì)胞NF200、MAP2、SYN1、GFAP蛋白表達(dá)情況。免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)誘導(dǎo)得到的細(xì)胞NF200、SYN1、MAP2、GFAP蛋白表達(dá)情況。Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)誘導(dǎo)得到的細(xì)胞NF200、SYN1、MAP2、GFAP蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:體外培養(yǎng)的第3代大鼠BMSCs細(xì)胞胞漿豐富,多呈長(zhǎng)梭形,部分為多角形,細(xì)胞聚集生長(zhǎng)呈漩渦狀。分離培養(yǎng)得到的大鼠BMSCS陽(yáng)性表達(dá)CD29、CD44,陽(yáng)性率分別為99.44%、99.17%。大鼠BMSCs成脂誘導(dǎo)28天后胞漿內(nèi)出現(xiàn)脂滴,油紅O染色陽(yáng)性。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明25ng/ml、50ng/ml、75ng/ml及100ng/ml的BMP-7對(duì)大鼠BMSCs的增殖均具有促進(jìn)作用,其中75ng/ml的BMP-7促進(jìn)大鼠BMSCs增殖作用最顯著。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明25 ng/ml BMP-7組、50 ng/ml BMP-7組、75 ng/ml BMP-7組、100 ng/ml BMP-7組細(xì)胞形態(tài)均有不同程度的變化,尤以75 ng/mlBMP-7組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化最為顯著,形態(tài)上類似于神經(jīng)元細(xì)胞。大鼠BMSCs經(jīng)BMP-7(75 ng/ml)誘導(dǎo)2 h后,BMP-7組NF200 mRNA相對(duì)表達(dá)量為(5.47±0.59)顯著高于對(duì)照組(P0.05),BMP-7組SYN1 mRNA相對(duì)表達(dá)量(1.48±0.38)顯著高于對(duì)照組(P0.05),BMP-7誘導(dǎo)組MAP2 mRNA相對(duì)表達(dá)量(2.86±1.65)顯著高于對(duì)照組(P0.05),BMP-7誘導(dǎo)組GFAP mRNA相對(duì)表達(dá)量(4.41±0.13)顯著高于對(duì)照組。免疫組化結(jié)果表明大鼠BMSCs經(jīng)BMP-7誘導(dǎo)2 h后,陽(yáng)性表達(dá)NF200、MAP2及SYN1,陰性表達(dá)GFAP。免疫熒光結(jié)果表明大鼠BMSCs經(jīng)BMP-7誘導(dǎo)后2 h后,誘導(dǎo)得到的細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)NF200、MAP2、SYN1,且主要在胞漿及形成的突起中表達(dá),陰性表達(dá)GFAP。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大鼠BMSCs經(jīng)BMP-7誘導(dǎo)2h后,BMP-7組NF200的相對(duì)表達(dá)量(1.091±0.0060)顯著高于對(duì)照組(0.4385±0.0046)(p0.01),BMP-7組SYN1的相對(duì)表達(dá)量(1.293±0.0029)顯著高于對(duì)照組(0.9885±0.0018)(p0.01),BMP-7組MAP2的相對(duì)表達(dá)量(1.167±0.0045)顯著高于對(duì)照組(0.9697±0.0031)(p0.01),BMP-7組GFAP的相對(duì)表達(dá)量(0.6130±0.0012)顯著低于對(duì)照組(0.9286±0.0029)(p0.01)。結(jié)論:1.BMP-7具有促進(jìn)大鼠BMSCs增殖的作用。2.BMP-7誘導(dǎo)大鼠BMSCs向神經(jīng)元分化的最佳濃度為75 ng/ml。3.BMP-7誘導(dǎo)大鼠BMSCs得到的細(xì)胞在形態(tài)上與神經(jīng)元細(xì)胞相似,陽(yáng)性表達(dá)神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物,證實(shí)BMP-7在體外具有誘導(dǎo)大鼠BMSCs分化為神經(jīng)元的作用。
【圖文】：

圖 1 大鼠 BMSCs 的形態(tài)學(xué)觀察（a：×100 b：×400）Fig.1 Morphological observation of rat BMSCs (a: × 100 b: × 400)2. 大鼠 BMSCs 細(xì)胞表型 CD29、CD44 的表達(dá)情況流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離、培養(yǎng)得到的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞表型 CD29、CD44的結(jié)果顯示，分離、培養(yǎng)得到細(xì)胞均一表達(dá) CD29、CD44，陽(yáng)性率分別為 99.44%、99.17%。

誘導(dǎo)至第 7d 可見胞漿內(nèi)出現(xiàn)小油滴，見圖3a；隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，脂滴逐漸增多并融合為較大的脂滴，見圖 3b；誘導(dǎo) 4w 后行油紅 O 染色，，經(jīng)油紅 O 染色，顯微鏡觀察，可見脂滴均著橘紅色，見圖 3c、d。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R651.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2591379