【摘要】：骨相關(guān)疾病隨著人口老齡化到來發(fā)病率越來越高,骨疾病中骨量減少、骨硬化、骨質(zhì)疏松等與骨分化紊亂相關(guān),而骨分化紊亂的發(fā)生常伴隨炎癥因子升高等現(xiàn)象。因此探究炎癥因子對(duì)骨分化的調(diào)節(jié)及其可能機(jī)制是非常重要的。骨分化是一種骨形成過程,骨形成和骨重吸收之間平衡性決定骨骼的強(qiáng)度和完整性。骨形成和骨重吸收的不平衡會(huì)導(dǎo)致多種骨疾病,比如股骨頭壞死、骨質(zhì)疏松、創(chuàng)傷性骨病和代謝性骨疾病,在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人體內(nèi),腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor alpha,TNFα)的水平和活性增強(qiáng),破壞病人的關(guān)節(jié)和骨;同樣糖尿病及肥胖癥患者體內(nèi)也有較高水平的TNFα表達(dá),其骨密度及骨量相較健康人而言都較低,更易得骨質(zhì)疏松癥,而抗TNFα療法是提高骨礦密度的有效方法。之前的研究主要關(guān)注TNFα通過與其細(xì)胞表面受體結(jié)合,激活包括細(xì)胞核因子κB(nuclear factor-Kappa B,NF-κB)信號(hào)途徑在內(nèi)的多條信號(hào)途徑而調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化、激活和凋亡,而TNFα對(duì)成骨細(xì)胞分化及功能的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。因此研究TNFα對(duì)成骨細(xì)胞的分化的調(diào)節(jié)機(jī)制可能為炎癥性骨疾病的治療提供新的靶點(diǎn)。有研究表明葡萄糖是成骨細(xì)胞的主要營養(yǎng)物質(zhì),葡萄糖以胰島素依賴的方式利用葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(glucose transporter1,Glut1)在成骨細(xì)胞中穿梭,Glut1在骨骼形成的過程中先于成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子(Runt-related transcription factor 2,Runx2)表達(dá),Runx2的累積和成骨分化必須有足夠葡萄糖來提供能量。TNFα影響Glut1的表達(dá)在癌細(xì)胞中已有研究,但在成骨細(xì)胞分化中是否通過調(diào)節(jié)Glut1來起作用還不清楚。所以基于以上,論文首先利用前成骨細(xì)胞MC3T3-E1檢測TNFα對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響。用免疫印跡(Western blot,WB)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,Q-PCR),堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)酶活檢測等實(shí)驗(yàn),檢測TNFα對(duì)成骨分化標(biāo)志基因和蛋白表達(dá)的影響。為進(jìn)一步探索TNFα影響成骨細(xì)胞分化的分子機(jī)制,敲降p65來探究NF-κB信號(hào)通路在其中的作用。此外,我們觀察到TNFα對(duì)Glut1的調(diào)節(jié)效果,敲降和過表達(dá)Glut1來探究Glut1在TNFα影響成骨分化過程中的作用。在MC3T3-E1細(xì)胞中,主要研究結(jié)果:(1)TNFα可以激活MAPK、AKT和NF-κB信號(hào)通路。(2)TNFα可以抑制成骨分化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和WB結(jié)果表明TNFα抑制成骨分化標(biāo)志基因和蛋白的表達(dá),同時(shí)ALP酶活檢測證明TNFα對(duì)堿性磷酸酶酶活的抑制作用具有濃度依賴性。(3)敲降p65增加了成骨分化標(biāo)志蛋白R(shí)unx2的蛋白表達(dá),但不能拯救TNFα對(duì)Runx2的抑制作用。(4)TNFα短時(shí)間處理增加Glut1的蛋白表達(dá),長時(shí)間處理抑制Glut1的蛋白表達(dá)。(5)敲降Glut1降低Runx2的蛋白表達(dá),ALP染色和ALP酶活檢測結(jié)果證明,敲降Glut1降低成骨分化過程中ALP的表達(dá)和酶活。過表達(dá)Glut1上調(diào)了Runx2的蛋白表達(dá),但不能拯救TNFα對(duì)Runx2的抑制作用。結(jié)論:在MC3T3-E1細(xì)胞中,TNFα可以激活MAPK、AKT、NF-κB信號(hào)通路;TNFα抑制成骨分化;抑制NF-κB信號(hào)通路可以促進(jìn)Runx2的表達(dá),但不能拯救TNFα對(duì)Runx2的抑制效果,這證明了TNFα不是完全通過NF-κB信號(hào)通路來影響成骨細(xì)胞分化;另外,TNFα可以影響Glut1的表達(dá),Glut1可以調(diào)控Runx2的蛋白表達(dá)水平,然而,過表達(dá)Glut1不能阻止TNFα對(duì)Runx2的抑制作用。這些結(jié)果表明TNFα對(duì)Runx2以及骨化作用的影響是通過多條通路協(xié)同進(jìn)行的。我們的結(jié)果進(jìn)一步對(duì)TNFα影響成骨分化的分子機(jī)制進(jìn)行了探究,可能為炎癥性骨疾病的治療提供新的靶點(diǎn)。
【圖文】：

第 部分 成骨細(xì)胞分化過程中腫瘤壞死因子α對(duì)GLUT1表達(dá)的調(diào)節(jié)及可能機(jī)制OPG、OPN 表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)各標(biāo)志蛋白在不同時(shí)間都有不同程度的表達(dá)上調(diào)（圖3.1A）。在細(xì)胞成骨分化不同天數(shù)提取 RNA 樣品，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測各成骨分化標(biāo)志基因 Runx2、OPG、BSP、ALP、OC 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其 mRNA 水平在不同時(shí)間開始有不同程度的表達(dá)上調(diào)，并且與相應(yīng)蛋白表達(dá)水平相 致（圖 3.1B）。MC3T3-E1 細(xì)胞成骨分化 21 天，做 Von Kasso 染色，檢測 MC3T3-E1 細(xì)胞成骨礦化能力，結(jié)果顯示該細(xì)胞有明顯的礦化現(xiàn)象（圖 3.1C）。 MC3T3-E1 細(xì)胞成骨分化 7 天提取蛋白樣品，檢測堿性磷酸酶活性，結(jié)果顯示堿性磷酸酶活性在分化過程中有所增加，且與 mRNA 表達(dá)水平 致（圖 3.1D）。證明了 MC3T3-E1 細(xì)胞有良好的分化和礦化能力。

圖 3.2 TNFα 對(duì) MAPK、AKT、NF-κB 信號(hào)通路的影響。A.分別用 0、1、10、30 ng/ml TNFα的濃度梯度處理 MC3T3-E1 細(xì)胞 24h，提蛋白后 WB 檢測 ERK、p38 和 JNK 蛋白的表達(dá)情況。B.分別用 10 ng/ml TNFα 處理 MC3T3-E1 細(xì)胞 0、10、30 min 和 3、6、24 h，，提蛋白后檢測AKT、ERK、p38、JNK 及其磷酸化蛋白表達(dá)情況。C.用 10 ng/ml TNFα 和等體積的 DMSO 處理 MC3T3 細(xì)胞 24 h，免疫熒光檢測 NF-κB p65 蛋白在細(xì)胞中的分布情況。3.3 TNFα 長時(shí)間處理激活 NF-κB 信號(hào)通路并抑制成骨分化已經(jīng)證明 TNFα 能夠激活 NF-κB 信號(hào)通路，進(jìn) 步檢測 10 ng/ml TNFα 對(duì)成骨分化的影響，在長時(shí)間分化的不同時(shí)間點(diǎn)，提取蛋白樣品，檢測 TNFα 持續(xù)處理MC3T3-E1 細(xì)胞對(duì)各成骨分化標(biāo)志蛋白 Runx2、OPG、OC、OPN 表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)在長時(shí)間分化處理過程中 TNFα 可以抑制成骨分化標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)TNFα 對(duì) NF-κB 信號(hào)通路表現(xiàn)為持續(xù)激活（圖 3.3A）。 Q-PCR 顯示檢測成骨 10ng/ml TNFα 對(duì)成骨分化標(biāo)志基因 Runx2、OPG、BSP、ALP、OC 的影響，發(fā)現(xiàn) TNFα可以明顯抑制各成骨分化標(biāo)志基因 mRNA 水平的表達(dá)，與相應(yīng)蛋白表達(dá)的抑制效
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R68

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本文編號(hào)：2591408